一种富含乳脂肪球膜蛋白、磷脂和低聚糖的婴幼儿配方奶粉及其制备方法与流程

2021-01-07 10:01:47|

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本发明涉及食品工程领域，尤其涉及一种富含乳脂肪球膜蛋白、磷脂和低聚糖的婴幼儿配方奶粉及其制备方法。

背景技术：

分娩后婴儿的胃肠道结构和功能迅速适应从肠外营养(胎盘)向肠内营养(初乳/奶粉)的转变，在这个过程中并伴随着动态微生物定植。婴儿时期肠道微生物群的初步建立，参与肠道发育、代谢稳态和免疫防御多重相互作用，为以后长期健康奠定了关键基础。因此，新生儿肠道发育和微生物定植成为终生健康的窗口机会。由于出生后肠道微生态具有高度可塑性，在婴儿期易受营养摄入和周围环境的影响，宿主的健康生长需要优越的完整性和功能性肠道。此外，定植微生物群参与营养代谢，其代谢产物也有助于肠道屏障的完整性。因此，早期细菌最优定植影响了屏障功能，对肠道发育和新生儿生长起着至关重要的作用。

人乳是婴儿最理想的天然食物，已知人乳中有2000多种成分。人乳蛋白质也可以分为黏蛋白(mucins)、酪蛋白(casein)和乳清蛋白(whey)三组。黏蛋白也被称为乳脂肪球膜蛋白(milkfatglobulemembrane，mfgm)，mfgm是一种包裹乳脂球的脂质-蛋白质复合物，对肠道消化、生理和调节微生物种群产生有利影响，有相关报道称其能加速婴幼儿和仔猪的生长发育。乳脂肪球膜的脂质主要由中性脂和极性脂，以及少量的糖脂构成。磷脂是一种极性脂，是脂质的主要组成部分，可以促进脂肪消化产物在消化道的吸收和转运，同时磷脂还参与机体免疫调节和神经信号转导等功能。人乳脂肪球中主要存在的磷脂包括鞘磷脂(sm)、卵磷脂(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)和磷脂酰肌醇(pi)。乳脂肪球膜的中性脂如甘油三职(tag)、甘油二脂(dag)、胆固醇及其脂类。

低聚半乳糖(gos)和多聚果糖(fos)是宿主微生物选择性利用的益生元，赋予益生元在健康方面的作用。gos和fos的研究显示出对有益菌定殖的偏好，如乳酸菌，它对微生物菌群的代谢活性产生了与母乳低聚糖类似的影响。gos和fos在肠道发育和免疫应答方面也有很好的应用，gos和fos是肠道菌群发酵产生短链脂肪酸(shortchainfattyacids,scfas)的益生元，对肠道的发育和生长具有有利作用。此外，源自牛奶的乳脂球膜(mfgm)在代谢调节和肠道稳态方面表现出营养生物活性。mfgm还能改变肠道菌群组成，增强肠道屏障功能。但婴儿期肠道发育和微生物定植是生长期的关键步骤，前人研究中关于mfgm研究和应用大多集中在组分分离、鉴定及通过代谢组学对其功能性质验证方面，但对婴儿肠道菌群定植、肠道微生态系统发育和屏障完整性的影响尚不清楚；gos和mfgm干预的混合干预被报道可以改善仔猪的神经发育。但gos、mfgm、fos三者联合作用对肠道微生物组成和肠道发育的影响尚不明确。

技术实现要素：

为解决现有技术问题，本发明的目的提供一种富含乳脂肪球膜蛋白、磷脂和低聚糖的婴幼儿配方奶粉。该奶粉以生牛乳为原料、填加富含mfgm的乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉、低聚半乳糖和多聚果糖调制而成，通过配方调整提升具有特殊功能成分的生物活性物质mfgm-蛋白，乳铁蛋白(lf)、α-乳白蛋白(α-la)、总低聚半乳糖(gos)、总多聚果糖(fos)、唾液酸、总磷脂、鞘磷脂(sm)、卵磷脂(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)和磷脂酰肌醇(pi)、神经节苷脂(gang)、甘油三职(tag)、甘油二脂(dag))的含量，达到促进婴儿肠道菌群中益生菌的定植尤其显著富集肠道内的乳酸菌同时减少未分类菌科等杂菌，提高肠道中免疫因子的含量和降低肠道疾病发生率的目的，该配方适用于婴儿和较大婴儿配方乳粉的开发。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种富含乳脂肪球膜蛋白、磷脂和低聚糖的婴幼儿配方奶粉，以生牛乳为原料，填加富含mfgm的乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉、低聚半乳糖和多聚果糖调制而成；其中每100克所述婴幼儿配方奶粉中功能活性成分的含量为总mfgm-蛋白0.146-0.438g、总α-乳白蛋白0.22-0.35g、总乳铁蛋白0.2-0.6g、免疫球蛋白igg0.1-0.3g、乳凝集素0.025-0.075g、muc1/mucin10.035-0.105g、总低聚半乳糖0.015-0.4g、总多聚果糖0.001-0.003g、唾液酸0.05-0.15g、总磷脂0.175-0.525g、神经鞘磷脂0.04-0.12g、神经节苷脂0.005-0.015g、卵磷脂0.06-0.19g、磷脂酰乙醇胺0.04-0.14g、磷脂酰肌醇0.02-0.06g、磷脂酰丝氨酸0.007-0.021g、甘油二脂0.0174-0.0371g、甘油三脂0.0311-0.0598g。见表1。

表1具有促进肠道健康的婴儿配方奶粉中功能活性成分的含量

上述婴幼儿配方奶粉，其中按照1吨婴幼儿配方奶粉计，富含mfgm的乳清蛋白粉的添加量25kg-75kg，α-乳白蛋白粉添加量8kg-75kg，低聚半乳糖添加量44kg-133kg和多聚果糖添加量1.8kg-5.5kg；牛初乳按照100l鲜奶制成15-16公斤牛初乳粉填加。按照上述比例填加调配出的婴幼儿配方奶粉具有较高的总α-乳白蛋白活性成分。

进一步优选，按照1吨婴幼儿配方奶粉计，富含mfgm的乳清蛋白粉的添加量55kg-65kg，α-乳白蛋白粉添加量8kg-15kg，低聚半乳糖添加量97kg-115kg和多聚果糖添加量4kg-5kg。

牛乳α-乳白蛋白与人乳的α-乳白蛋白只有76％的氨基酸序列一致，α-乳白蛋白对婴儿具有非常高的营养价值，其氨基酸组成非常类似于婴儿氨基酸需要量及氨基酸模式。已证明α-乳白蛋白是乳糖合成酶的一部分，在乳腺参与乳糖的合成。乳糖合成酶由两种蛋白质组成，即α-乳白蛋白和半乳糖基转移酶，它们共同催化葡萄糖与udp-半乳糖的结合。α-乳白蛋白在婴儿肠道中被消化时，产生的多肽具有抗菌、增强婴儿免疫力的作用；最近发现的α-乳白蛋白多聚体也具有抗感染、促进细胞凋亡的作用，这些功能对保护婴儿肠道健康具有重要意义。本发明的配方中特别填加了α-乳白蛋白协同提高婴儿肠道健康的作用。

本发明上述婴幼儿配方奶粉中还可以添加其它配料如脂肪类、乳糖、矿物质、维生素及一些可选营养成分(胆碱、肌醇、牛磺酸、肉碱等)进行配料标准化后，调制出的婴儿配方乳粉具有促进婴儿肠道健康的作用。

本发明一种富含乳脂肪球膜蛋白、磷脂和低聚糖的婴幼儿配方奶粉的制备方法，包括如下步骤：以生牛乳作为原料乳，净乳后进行预杀菌(85℃-88℃，30s)，向预杀菌的生牛乳中添加mfgm的乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉、低聚半乳糖、多聚果糖及其它配料，预杀菌(85℃-88℃，30s)，均质15mpa，杀菌(93℃-95℃，15s)，浓缩，喷雾干燥(进风温度150℃-160℃，出风温度85℃-90℃)即可。

本发明所述的产品营养指标、理化指标、微生物指标及感官指标的检测严格按照食品安全国家标准婴儿配方食品(gb-10765-2010)指定的检测项目及检验方法进行。

本发明另一个具体实施例是涉及一种利用高通量测序技术对仔猪粪便中16srdna基因进行测序分析，考察了本发明的配方奶粉对生长发育与肠道菌群构成的影响。

有益效果

本发明开发的具有促进婴儿肠道健康的配方乳粉，通过添加富含mfgm的乳清蛋白粉、α发乳白蛋白粉、低聚半乳糖和多聚果糖，提高配方中具有特殊功能作用的总mfgm-蛋白、低聚半乳糖、多聚果糖、乳铁蛋白、α-乳白蛋白、igg、乳凝集素、muc1/mucin1、磷脂、神经节苷脂、神经鞘磷脂和唾液酸多种功能活性成分的含量，使其尽量接近于母乳。新生儿出生后，哺乳动物的肠道形态和功能必须适应从无菌子宫到细菌丰富的环境的转变，因此，新生儿期是微生物定植的关键窗口。通过仔猪模型实验，口服本发明配方能够改善仔猪生长性能和降低血浆igg水平，激活仔猪肠道内益生菌定植，显著富集肠道内的乳酸菌同时减少未分类菌科等杂菌。增强肠道屏障功能通过提高基因的表达紧密连接(occludin和zo-1)，黏蛋白(mucin-2和mucin4)和细胞因子(il-1β和il-22)，增强肠道屏障功能，提高新生仔猪的生长性能。我们的研究结果将为gos、mfgm和fos在调节婴儿早期肠道微生态中起着非常重要的作用,该产品适用于婴儿及较大婴儿配方乳粉的开发。

附图说明

图1是本发明实施例1的新生仔猪第八天粪便菌群组成：

其中图a是多样性(sobs指数)；图b是香农指数(shannon指数)；图c是基于未加权unifrac距离的pcoa的β多样性；图d是基于wilconxon秩和检验的差异微生物组成；图e是属水平的线性别分析效应大小(lefse)分析，线性判别分析(lda)评分>4；*p<0.05；**p<0.01。

图2是本发明实施例1的新生仔猪第21天粪便菌群组成：

图3是本发明实施例1的新生仔猪肠道菌群功能状况：

其中图a为第八天京都基因和基因组百科全书(kegg)的差异丰度；图b为第二十一天京都基因和基因组百科全书(kegg)的差异丰度。

图4是本发明实施例121天新生仔猪肠道屏障相关基因表达和肠道通透性的影响：

肠屏障相关基因在回肠粘膜(a-c)和结肠粘膜(d-f)中的表达；血浆dao水平表达(g)。

图5是本发明实施例1的仔猪粪便scfas浓度及肠道gprs基因的影响：

其中仔猪粪便短链脂肪酸浓度差异(a)与受体基因表达(b)

图6是本发明实施例1的本发明的生产流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1婴儿配方奶粉中活性成分与母乳及对比例的比较，见表2

对比例：cn106359604a

表2

从上述比较可见，本发明的配方奶粉，活性成分更加全面接近母乳，尤其总α-乳白蛋白、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、甘油二脂、甘油三脂都是cn106359604a中不存在的成分。总乳铁蛋白要比对比例中高近10倍的量，与母乳减少差距。

表2中活性成分的按照下述方法调制而成，采用湿法加工工艺，图6所示。以生牛乳为原料乳，净乳后进行预杀菌，向预杀菌的生牛乳2000l中添加mfgm的乳清蛋白粉60kg、α-乳白蛋白粉10kg、低聚半乳糖106kg、多聚果糖4.33kg，均质，杀菌，浓缩，干燥即可。

上述方法中主要工艺参数为：所述预杀菌(85℃-88℃，30s)；均质15mpa；杀菌(93℃-95℃，15s)；喷雾干燥(进风温度150℃-160℃，出风温度85℃-90℃)。

本发明所述的产品营养指标、理化指标、微生物指标及感官指标的检测严格按照食品安全国家标准婴儿配方食品(gb-10765-2010)指定的检测项目及检验方法进行。实施例2基于仔猪模型对产品影响肠道微生态评价

1.试验方法

1.1基仔猪模型建立和样本采集

选择16只仔猪(1.53±0.04公斤)从不同的窝(每窝一个仔猪)被随机分配到对照组喂食生理盐水(简称con组)和实验组喂食低聚半乳糖、mfgm的乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉、低聚半乳糖、多聚果糖(简称gmf组本发明实施例1)。新出生第1天至第7天，gmf组的仔猪每天使用5mlgmf溶液(1g/kg体重)，con组仔猪饲喂等量生理盐水。在整个哺乳期，仔猪正常摄取母猪奶和水。商业饲料从产后第8天开始添加。每日监测健康状况，记录第21天的体重；第21天，选择5只仔猪(约为每组平均体重)，并从颈静脉取样仔猪血样。在3000g下，在4℃下离心10分钟后，收集血浆。然后，收集粪便，并在液氮中快速冷冻，进行微生物组成分析。对仔猪安乐死后，将十二指肠、空肠和回肠标本固定在10％磷酸盐缓冲福尔马林中进行形态学评价。快速获得中柱和中柱的粘膜，并将其冷冻在液氮中进行基因表达鉴定。所有样品保存在-80℃，直到进一步分析。

1.2基于仔猪模型建立样本检测方法

1.2.1仔猪血浆样本检测

用elisa方法测定仔猪血浆中二胺氧化酶(dao)和免疫球蛋白(包括iga、igg和igm)的含量。

1.2.2仔猪肠道微生态检测

从10％磷酸盐缓冲福尔马林液中取出肠道样品，通过分级乙醇系列(70％～100％)脱水，然后用二甲苯清除，并嵌入石蜡。连续切片(5μm厚)，利用成像显微镜，测量了至少15个完整和定向良好的绒毛及其每个片段的相关隐窝放大率。从绒毛尖端到绒毛隐窝交界处测量绒毛高度，并将隐窝深度定义为相邻绒毛之间的内陷深度。

1.2.3仔猪粪便高通量16srrna测序

用引物扩增16srrna基因的v3-v4区域，并用axyprepdna凝胶提取试剂盒纯化。然后，将纯化的pcr产物汇集成等摩尔量，在平台上测序。

1.2.4仔猪粪便短链脂肪酸的测定

用离子色谱仪对仔猪粪便样本中短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸在内进行定量分析。

2.结果

2.1gmf对仔猪生长发育影响

2.1.1gmf对仔猪体重影响

如表3所示，与con组仔猪重要相比，gmf组显著增加了第8天和第14天仔猪的体重(p<0.05)。此外，gmf组1-8、1-21日平均日增重和全周期(1-21日)均有显著升高(p<0.05)。

表3mfgm和lf对于仔猪体重影响

2.1.2gmf对仔猪血浆中igg浓度影响

如表4可知，第21天仔猪血浆中igg浓度在gmf喂养后显著升高(p<0.05)，而glu、iga、igm、tg、hdl-c和ldl-c等其他参数无差异。嗜乳脂蛋白(btn)、粘蛋白(muc)、黄黄嘌呤氧化还原酶(xor)、乳黏素(mfg-e8)和脂肪酸结合蛋白(fabp)具有不同的生化特性。先前的研究表明，配方中的gmf补充剂对婴儿和动物的新生儿健康和肠道成熟具有促进生长的作用，本研究中血浆igg水平的升高表明。

表4.mfgm和lf对于仔猪第21天的血浆影响

2.1.3gmf对仔猪肠形态道发育影响

为了确定仔猪的肠道形态发育，测定了仔猪的绒毛高度和隐窝深度(表5)。结果表明，gmf组可明显提高十二指肠和回肠的绒毛高度，而降低十二指肠隐窝深度(p<0.05)。

表5.mfgm对于仔猪第21天的肠道微生态影响

2.2gmf对于仔猪肠道菌群影响

为了研究con和gmf两组仔猪早期菌群的差异，采用16srrna高通量测序技术对其微生物多样性、组成及差异进行了评价。

2.2.1仔猪菌群构成

仔猪出生第8天粪便菌群如图1所示，α-多样性指数分析显示gmf组多样性(sobs)指数明显下降(p<0.05)(图1a)，而香农指数不改变(图1b)；β-多样性，pcoa分析显示con组和gmf组之间差异显著(图1c)；从菌群构成的角度，仔猪的差异菌群表明，gmf可以显著富集乳酸菌，减少未分类菌科(p<0.05)(图1d)。线性判别分析效应量(lefse)分析也证实gmf组仔猪乳酸菌显著升高(图1e)。

仔猪出生第21天粪便菌群如图2所示，α-多样性，图2a和图2b显示gmf组多样性(sobs)指数和香农指数显著增加；β-多样性，pcoa分析显示con组与gmf组之间存在显著差异(图2c)；在菌属水平上菌群差异显示(图2d拟杆菌、肠球菌、克里斯滕森菌和罗布西亚菌呈现增加趋势，而真杆菌属成员呈现下降趋势；线性判别分析效应量(lefse)分析显示(图2e)gmf组的拟杆菌、肠球菌、罗布西亚菌、g_反刍动物科_ucg-002、g_克里斯滕森_r-7_group、g_马文步里安提亚科、g_chkci001和未分类菌属在gmf组呈现显著上升趋势。

2.2.2仔猪菌群功能

为了进一步探索细菌群落的功能概况，我们利用kegg数据库，通过picrust，对群落进行系统发育研究。如图3a所示，第8天，gmf增加了糖酵解/糖异生作用、甘油脂代谢、mapk信号通路、内噬作用、类黄酮生物合成、咖啡因代谢显著升高，而与卟啉和叶绿素代谢、氮代谢相关的基因降低。图3b第21天，gmf干预显著富集了甲烷代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化磷酸化、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、丁酸盐代谢、脂质生物合成蛋白、丙酸盐代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、rna聚合酶、柠檬烯和蒎烯降解，但与其他离子偶联转运体和其他转运体连接的基因下降。

2.3gmf对仔猪肠道功能影响

2.3.1仔猪肠道屏障功能

为明确肠屏障功能和肠通透性，检测肠屏障相关基因在黏膜(回肠和结肠)和血浆dao水平的表达。仔猪回肠紧密连接蛋白(e-钙黏着蛋白、zo-1)(图4a)、粘蛋白(黏蛋白-1、黏蛋白-2、黏蛋白-4)(图4b)、il-22(图4c)基因表达在gmf组中显著升高(p<0.05)。同样，仔猪结肠中紧密连接蛋白的基因表达(封堵器表达，连接蛋白-1和zo-1)(图4d)，黏蛋白-20(图4e)和细胞因子(tnf-α和il-1β)(图4f)在gmf组中显著升高(p<0.05)。gmf组血浆dao水平显著降低(p<0.05)(图4g)。

2.3.2仔猪粪便scfas浓度以及受体基因表达

仔猪粪便中scfas的浓度及其在肠道中的受体基因表达。结果表明，gmf组乙酸、丙酸和丁酸的浓度均显著高于con组(p<0.05)(图5a)此外，gmf组增加了gpr41在结肠粘膜中的基因表达(图5b)。gmf组短链脂肪酸浓度及其受体(gpr41)升高促进了丙酸代谢，调节益生菌定植和短链脂肪酸代谢，最终激活了肠细胞，增强了肠道屏障功能。

综上所述，通过仔猪模型实验可知，口服gmf(低聚半乳糖、α-乳白蛋白粉、mfgm蛋白乳清粉和多聚果糖)仔猪可以显著提高生长性能和降低血浆igg水平，出生后一周产生了益生菌定植(乳酸菌、肠球菌和罗布西亚菌)，促进了短链脂肪酸的产生，增强肠道屏障功能通过提高基因的表达紧密连接(封堵器蛋白和zo-1)，黏蛋白(黏蛋白-2和黏蛋白-4)和细胞因子(il-1β和il-22)，因此提高仔猪的生长性能在整个新生儿期。我们的研究结果将为低聚半乳糖、α-乳白蛋白粉、乳脂肪球膜蛋白和多聚果糖在调节婴儿早期肠道微生态中起着非常重要的作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

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