一种背蛇生的人工高效繁殖方法与流程

本发明涉及中草药繁殖技术领域，具体为一种背蛇生的人工高效繁殖方法。

背景技术：

背蛇生(aristolochiatuberosac.f.liangets.m.hwang)为马兜铃科(aristolochiaceae)马兜铃属(aristolochia)多年生草质藤本，又名毒蛇药、避蛇生，朱砂莲等，为我国特有药用植物，主要分布于广西、云南、贵州和四川等省份，生于海拔150-1600m石灰岩山上或山沟两旁灌丛中。背蛇生块根入药，味苦、辛，性寒，有小毒，具有消炎消肿，清热解毒、散血止痛之效，民间用药主要治疗胃炎、胃溃疡、痈疡肿毒、牙痛、喉痛、吐血、蛇伤有较佳的疗效。

随着大健康产业的迅猛发展，背蛇生不再仅限于民间的中医药应用。现代医药学和临床研究表明，背蛇生富含马兜铃酸和朱砂莲甲素等抑制金色葡萄球菌的生长，提高细胞免疫、抗癌，治疗多种慢性病的活性物质，具有广阔的市场应用前景。目前，由于生境日益恶劣，背蛇生已濒于灭绝，其资源已远远不能满足国内外市场需求。背蛇生通常以其种子为繁殖单位。但种子萌发率低，实生苗生长缓慢且生物量较小、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化(基因型背景一致)种植和高药效品种的大面积推广。

因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的高效人工繁殖方法来扩大背蛇生种苗的繁殖量，进行其高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明提供了一种背蛇生的人工高效繁殖方法，以解决背蛇生种子繁殖萌发率低，实生苗生长缓慢且生物量较小、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化种植，高药效品种难以大面积推广的问题。

根据本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

一种背蛇生的人工高效繁殖方法，将消毒灭菌处理后的带节茎段外植体经启动培养、基茎丛生芽发生和增殖、不定根诱导、驯化移栽，包括如下步骤：

步骤1：外植体的获取

选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下含2-3节茎段；

步骤2：消毒处理

将步骤1获取的带节茎段进行消毒处理；

步骤3：启动培养

将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，接入培养基a中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行腋芽萌发诱导；

步骤4：基茎丛生芽诱导增殖培养

在步骤3培养基a中继代增殖2代时，将步骤3中培养的增殖苗转入培养基b中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行基茎丛生芽诱导增殖培养；

步骤5：

取步骤4丛芽中的健壮主苗接种于培养基c中，控制光照度、温度、光照时间的条件下获得苗壮根粗的生根苗；

步骤6：炼苗和移栽。

进一步地，步骤3中，所述a培养基包括以下原料：

ms培养液

玉米素zt1.5-2.0mg/l、

蔗糖30000mg/l

琼脂粉4800mg/l。

进一步地，所述a培养基的ph值为5.4-5.8。

进一步地，所述b培养基，包括以下原料：

ms培养液

进一步地，所述b培养基的ph值为5.4-5.8。

进一步地，所述c培养基，包括以下原料：

1/2ms培养液

进一步地，所述c培养基的ph值为5.4-5.8。

进一步地，步骤1中所述带节茎段进行消毒处理的方法为：

流水洗净后用质量比为15％洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗1h后置于超净工作台中；

用体积比75％乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒8min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果；

最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水，最终得到消毒灭菌处理的外植体。

进一步地，步骤6中，炼苗和移栽的方法如下：

取步骤5的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3-5min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，即得移栽苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明一种背蛇生的人工高效繁殖方法，利用组织培养技术，对背蛇生快速繁殖体系进行了优化，在同一培养基中，可同时进行基茎丛生芽发生和增殖培养，简化了培养程序；在无菌体系建立后，整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了从基茎丛生芽发生和增殖到生根的过程，十分利于安排生产计划。本发明增殖速度快，增殖系数大，以基茎丛生芽为中间繁殖体，属直接器官发生，变异小，且40-45d为一个培养周期，繁殖系数达10.0以上。

2、本发明一种背蛇生的人工高效繁殖方法，可进行周年工厂化连续生产，生产效率高，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。在材料有限的情况下，先采用启动培养，诱导腋芽萌发以扩大基数，在材料充足的情况下，便于下一步的生产安排。

3、本发明一种背蛇生的人工高效繁殖方法，使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题。为保护其野生资源和发展人工种植奠定技术基础，同时将优良性状固定下来，可提供基因型背景一致的优质种苗以满足大面积推广种植的需求。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对发明的限制。在附图中：

图1为背蛇生的启动培养过程示意图；

图2为背蛇生基茎丛生芽发生和增殖过程示意图；

图3为背蛇生生根培养与炼苗移栽过程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1、图2和图3所示，一种背蛇生的人工高效繁殖方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含第3至第5节，用手术刀切割为2.0cm左右长茎段。

2、将步骤1的带节茎段流水洗净后，用质量比为15％洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗1h后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒8min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，切割为1.8cm长、具2-3个节，接入下列培养基a中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数，10d后，节上腋芽开始萌发生长，20d后腋芽迅速生长，35d后基本长至培养瓶口，增殖系数仅为3.57±0.12。整个培养过程除茎段基部微微膨大、呈淡黄色外，未观察到明显的愈伤组织和不定芽发生，偶见不定根出现。

4、基茎丛生芽诱导增殖培养：在步骤3培养基a中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗切割为2.0cm长、具2个节转接至转入下列培养基b中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养15d后，随着腋芽的萌发生长，近或接触培养基处节部开始膨大并伴有丛生发生，25d后，基部不定丛芽明显增多，并开始伸长，整体呈翠绿色，30d后，基茎丛生芽长势迅猛，叶片伸展，颜色由翠绿色转为深绿色；经过45d的培养，培养物形成簇状多枝多芽系统，增殖系数平均可达到10以上。在整个培养过程中，材料基部仅见少量黄色愈伤组织，未观察到其上有不定芽发生，而是节部异常膨大后产生大量不定丛芽。

5、取步骤4丛芽中高3-4cm的健壮主苗接种于下列培养基c中：

1/2ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养45d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。

6、炼苗和移栽：取步骤5长至8cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒3min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达100％。

实施例2

如图1、图2和图3所示，一种背蛇生的人工高效繁殖方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含第2至第3节，用手术刀切割为1.7cm左右长茎段。

2、将步骤1的带节茎段流水洗净后，用质量比为15％洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗1h后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒8min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，切割为1.5cm长、具2-3个节，接入下列培养基a中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数，10d后，节上腋芽开始萌发生长，20d后腋芽迅速生长，35d后基本长至培养瓶口，增殖系数仅为3.57±0.12。整个培养过程除茎段基部微微膨大、呈淡黄色外，未观察到明显的愈伤组织和不定芽发生，偶见不定根出现。

4、基茎丛生芽诱导增殖培养：在步骤3培养基a中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗切割为2.0cm长、具3个节转接至转入下列培养基b中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养15d后，随着腋芽的萌发生长，近或接触培养基处节部开始膨大并伴有丛生发生，25d后，基部不定丛芽明显增多，并开始伸长，整体呈翠绿色，30d后，基茎丛生芽长势迅猛，叶片伸展，颜色由翠绿色转为深绿色；经过45d的培养，培养物形成簇状多枝多芽系统，增殖系数平均可达到10以上。在整个培养过程中，材料基部仅见少量黄色愈伤组织，未观察到其上有不定芽发生，而是节部异常膨大后产生大量不定丛芽。

5、取步骤4丛芽中高3-4cm的健壮主苗接种于下列培养基c中：

1/2ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养45d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。

6、炼苗和移栽：取步骤5长至8cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒4min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达96％。

实施例3

如图1、图2和图3所示，一种背蛇生的人工高效繁殖方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其茎尖下茎段，含2-3节，用手术刀切割为1.5cm左右长茎段。

2、将步骤1的带节茎段流水洗净后，用质量比为15％洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗1h后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡10-15s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒8min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、启动培养：将经过步骤2消毒灭菌好的带节茎段为材料，切割为1.2cm长、具2个节，接入下列培养基a中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行启动增殖培养以扩大材料基数，10d后，节上腋芽开始萌发生长，20d后腋芽迅速生长，35d后基本长至培养瓶口，增殖系数仅为3.57±0.12。整个培养过程除茎段基部微微膨大、呈淡黄色外，未观察到明显的愈伤组织和不定芽发生，偶见不定根出现。

4、基茎丛生芽诱导增殖培养：在步骤3培养基a中继代增殖2代、材料基数足够时，将步骤3中培养的增殖苗切割为1.5cm长、具2个节转接至转入下列培养基b中：

ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养15d后，随着腋芽的萌发生长，近或接触培养基处节部开始膨大并伴有丛生发生，25d后，基部不定丛芽明显增多，并开始伸长，整体呈翠绿色，30d后，基茎丛生芽长势迅猛，叶片伸展，颜色由翠绿色转为深绿色；经过45d的培养，培养物形成簇状多枝多芽系统，增殖系数平均可达到10以上。在整个培养过程中，材料基部仅见少量黄色愈伤组织，未观察到其上有不定芽发生，而是节部异常膨大后产生大量不定丛芽。

5、取步骤4丛芽中高3-4cm的健壮主苗接种于下列培养基c中：

1/2ms培养液

培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下，培养45d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。

7、炼苗和移栽：取步骤5长至8cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒5min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达98％。

上述实施例中，图1中：a为接种10d后，节处腋芽开始萌发；b为接种20d后腋芽迅速生长图；c为接种35d后腋芽基本长至培养瓶口图。

图2中：a为培养15d后，在腋芽萌发生长的同时，基节膨大并有芽点产生图；b、c为培养25d后，基茎不定芽明显增多，此时可偶见材料基部有黄色愈伤组织图；d为培养35d后的基茎丛生芽及主苗图；e、f为培养45d时的簇状多枝多芽系统图。

图3中：a为培养15d，不定根出现图；b为培养45d后苗壮根粗的试管苗，未见有愈伤组织产生图；c为移栽30d后的试管苗图。

上述实施例中，采用的技术原理说明如下：

1、外植体选用茎段，保证了其优质基因型的稳定性，解决了通过实生苗存在基因型参差不齐的问题。

2、本发明在野生材料有限的情况下，首先采用启动培养，诱导腋芽萌发的方式对背蛇生进行初步增殖，解决了起始培养进材料严重不足的问题。

3、本发明在启动培养以后，在同一培养基中，可同时进行基茎丛生芽发生和增殖培养，简化了培养程序；整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了从基茎丛生芽发生和增殖到生根的过程，大大缩短了育苗周期。

4、本发明生根过程中，无愈伤组织产生，不定根与试管苗维管束直接相连，达到了试管苗移栽的高成活率目标。

5、本发明提供的背蛇生的人工高效繁殖方法成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来；该方法可扩大背蛇生种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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