一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用。

背景技术：

茯苓多糖主要有β-(1，3)葡聚糖，具有活性的多糖免疫增强作用机制是从免疫器官、免疫细胞和免疫分子各层次上刺激巨噬细胞、淋巴细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、lak细胞和红细胞，增加这些细胞的数量，增强其细胞活性，促使其发挥作用。近三十年来，对茯苓多糖的研究显示，茯苓多糖通过增强机体的非特异性主动免疫功能来发挥作用，具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老的活性。茯苓多糖最大的优点是毒副作用小，细胞毒性小，对机体免疫系统具有双向调节作用，从而使机体内外平衡统一。

然而茯苓的功效并不是立竿见影，需要长时间的大量服用才能体现其功效。如果能进一步提高茯苓多糖的活性，将极大的推动茯苓多糖的产业化应用。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用，其目的在于通过茯苓多糖的高级构象改变，显著提高茯苓多糖的活性，由此解决现有的茯苓多糖活性不高的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种活性茯苓多糖，其为酸性羧甲基化茯苓多糖，取代度在0.6～0.7之间，分子量在120kda-180kda之间，具有三螺旋结构。

优选地，所述活性茯苓多糖，其溶解于超纯水中呈球状构象。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的活性茯苓多糖的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备羧甲基茯苓多糖水溶液：提取茯苓多糖并进行羧甲基化，获得羧甲基茯苓多糖，并溶解在水中获得羧甲基茯苓多糖水溶液；

(2)离子交换吸附：使步骤(1)获得的羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相充分接触，获得吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相；

(3)洗脱分离：将步骤(2)获得的吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相采用盐溶液洗脱，收集洗脱液后纯化获得所述活性茯苓多糖。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(2)采用的阴离子交换固相为阴离子交换树脂；优选地，所述阴离子交换树脂的小离子电量：0.88～1.08meg/dg；ph范围为3～10，更优选地，所述阴离子交换树脂为deae-52纤维素、和/或deae-sepharose。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(2)所述羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相接触时间在大于等于30min；优选每30-40mg羧甲基茯苓多糖使用阴离子交换固相100ml。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(1)获得的羧甲基茯苓多糖浓度在10-15mg/ml。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(1)所述羧甲基茯苓多糖的取代度在0.6-0.7。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(3)所述盐溶液为氯化钠溶液，其浓度在0.5mol/l以上，优选在0.6mol/l以上，更优选为0.6mol/l。

优选地，所述活性茯苓多糖的制备方法，其步骤(3)所述收集洗脱液后纯化具体包括透析、脱盐、和/或干燥；所述透析采用节流分子量3500-10000的透析膜，优选透析时间大于等于10小时。

按照本发明的另一个方面，提供了所述的活性茯苓多糖的应用，其应用于制备免疫调节制剂。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明首先将茯苓多糖羧甲基化提升茯苓多糖的溶解度，然后发现通过阴离子交换固相洗脱后的茯苓多糖发生分离和构象改变，其出现明显的三股螺旋结构，活性显著提升。

本发明制备的活性茯苓多糖，其在体内和体外显示出的免疫活性，皆不逊于阳性对照(lps和香菇多糖)，部分指标甚至远超阳性对照，用于制备免疫调节制剂，前景广阔，经济价值可观。

附图说明

图1是实施例1提供的茯苓多糖洗脱曲线；

图2是实施例3提供的茯苓多糖cmp、cmp-1、cmp-2红外光谱；

图3是实施例4提供的茯苓多糖cmp、cmp-1、cmp-2在流动相中的ri曲线图；

图4是实施例5提供的刚果红实验结果图；

图5是实施例5提供的cmp、cmp-1、cmp-2的透射电镜图片，其中图a为cmp的透射电镜图片，b为cmp-1的透射电镜图片，c为cmp-2的透射电镜图片；

图6是实施例6体外cmp、cmp-1和cmp-2对raw264.7细胞活力的影响；

图7是实施例6体外cmp、cmp-1和cmp-2对raw264.7细胞分泌no的影响；

图8是实施例6体外cmp1和cmp2对raw264.7细胞吞噬中性红的影响；

图9是实施例6体外cmp-1和cmp-2对raw264.7细胞分泌tnf-α(b)的影响；

图10是实施例6体外cmp-1和cmp-2对raw264.7细胞分泌il-6(c)的影响；

图11是实施例7体内cmp-1和cmp-2对raw264.7细胞分泌tnf-α(b)的影响；

图12是实施例8制备的cmp-3对raw264.7细胞分泌no的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的活性茯苓多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备羧甲基茯苓多糖水溶液：提取茯苓多糖并进行羧甲基化，获得羧甲基茯苓多糖，并溶解在水中获得羧甲基茯苓多糖水溶液；所述羧甲基茯苓多糖浓度在10-15mg/ml，所述羧甲基茯苓多糖的取代度在0.6-0.7。

所述羧甲基茯苓多糖优选按照如下方法制备：

先将干燥过的茯苓菌核进行粉碎过80或100目筛，得到粒度均匀的茯苓粉；以茯苓粉作为羧甲基化反应底物，加入乙醇溶液进行溶胀；溶胀后，加入氢氧化钠，进行碱化反应，反应结束后，进行冷却；然后，加入氯乙酸和过量的氢氧化钠与茯苓全粉进行羧甲基化反应，得到取代度在0.7左右的羧甲基茯苓多糖；所述乙醇溶液浓度为85％，溶胀料液比为酒精溶液∶茯苓粉＝5∶1或6∶1或7∶1；

在碱化反应中，所述的氢氧化钠加入的量为茯苓粉质量的0.3～0.4倍；加入氢氧化钠之后进行搅拌，碱化反应0.5～1h，反应温度为40～60℃；

羧甲基化反应中所述氯乙酸的加入量为茯苓粉质量的0.8～1.0倍，使茯苓粉和氯乙酸在过量的氢氧化钠下进行醚化反应5-7h，反应温度为50～70℃，反应完毕后，用冰乙酸调至ph至5.0～6.0，用体积分数80～90％的乙醇洗涤3～5次，除去多余氯离子，并至白色或淡黄色，在50℃温度条件下干燥。

(2)离子交换吸附：使步骤(1)获得的羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相充分接触，获得吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相；

优选地，采用的阴离子交换固相为阴离子交换树脂；

更优选地，所述阴离子交换树脂的小离子电量：0.88～1.08meg/dg；ph范围为3～10；蛋白容积425mg/dg左右，采用离子交换柱则蛋白容积/柱体积60mg/ml总有，柱床体积：0.19，填料密度的状态为0.05mph7.5磷酸缓冲液。

所述阴离子交换树脂优选为deae-52纤维素、和/或deae-sepharose。

所述羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相接触时间在大于等于30min。

每30-40mg羧甲基茯苓多糖使用阴离子交换固相100ml。

(3)洗脱分离：将步骤(2)获得的吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相采用盐溶液洗脱，收集洗脱液后纯化获得所述活性茯苓多糖。所述盐溶液为氯化钠溶液，其浓度在0.5mol/l以上，优选在0.6mol/l以上，更优选为0.6mol/l。

实验发现，茯苓多糖经阴离子交换固相吸附后，洗脱获得的茯苓多糖在在一级结构上无明显变化。而茯苓多糖的高级结构出现明显变化，刚果红实验证明其形成了三股螺旋结构、排阻法和透射电镜显示其分子尺寸明显缩小、围观形态发生变化。进一步的实验显示，这一系列的高级结构变化使得茯苓多糖的细胞活性明显提高，且与细胞活性的提高量效关系明确。

本发明制备的茯苓多糖相对于普通茯苓多糖，能够极其显著的促进raw264.7细胞增殖、分泌no、吞噬作用，分泌细胞因子(tnf-α和il-6),表现出明显的免疫促进活性，与阳性对照相当甚至远超阳性对照，能够应用于制备免疫调节制剂。

然而离子吸附和洗脱为固液反应，普通的茯苓多糖水溶性差，无法有效的与阴离子交换固相形成有效的静电吸附，本发明采用羧甲基茯苓多糖，使得浓度达到15mg/ml。实验显示，取代度在0.6至0.7的羧甲基茯苓多糖制得的终产品出现明显的三股螺旋结构，其免疫调节活性明显增强。

以下为实施例：

实施例1

本实施例提供的活性茯苓多糖按照如下方法制备：

(1)制备羧甲基茯苓多糖水溶液：提取茯苓多糖并进行羧甲基化，获得羧甲基茯苓多糖，并溶解在水中获得羧甲基茯苓多糖水溶液；所述羧甲基茯苓多糖浓度在15mg/ml，所述羧甲基茯苓多糖的取代度在0.6-0.7。

所述羧甲基茯苓多糖优选按照如下方法制备：

取1kg过100目筛的茯苓粉，加入5.0l85％乙醇在室温下搅拌溶胀30min，再加入0.3～0.5kg的氢氧化钠(用少量乙醇溶解)在50℃下搅拌碱化0.5～1.0h。然后再加入0.3～0.5kg氢氧化钠(用少量乙醇溶解)和0.8～1.0kg氯乙酸，在50～70℃温度条件下醚化3.0h。反应完毕后，用体积分数80％的乙醇洗涤4次，除去多余氯离子。在40～50℃下干燥7～10h，干燥，过80目筛，得到取代度为0.7左右的羧甲基茯苓多糖粉。所得白色粉末即为羧甲基茯苓多糖粉。

d·s按照灰碱法测定，测定方法如下：将已充分干燥后的改性产品连同瓷埚锅放进高温炉，700±25℃灼烧30min，冷却后先用少量水润湿含有焦粒的灰白粉末，然后洗移至烧杯中(总量不超150ml)，加入甲基红指示剂3滴，用0.05mol/lh2so4滴到显红色后，再从滴定管放入10ml，记下h2so4总用量a，将溶液放在电炉上加热，使之轻轻沸腾10min，不必冷却，即用0.1mol/l的naoh溶液滴定至变黄色为止，记下其用量b。计算公式:

取代度(d·s)＝0.162b/(l－0.08b)

b＝(a*nl－b*n2)/w

a一硫酸标准溶液用量(ml)

b一氢氧化钠标准溶液用量(ml)

nl一硫酸标准溶液当量浓度(0.05mol/l)

n2一氢氧化钠标准溶液当量浓度(0.lmol/l)w一样品重量(g)

本发明制备的cmp的取代度(d·s)＝0.705

将200mg羧甲基茯苓多糖(cmp)溶解于20ml蒸馏水中，形成羧甲基茯苓多糖水溶液。

(2)离子交换吸附：使步骤(1)获得的羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相充分接触，获得吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相；具体为：

将步骤(1)制备的羧甲基茯苓多糖水溶液通过deae-52纤维素(阴离子交换固相)，接触时间30min，每40mg羧甲基茯苓多糖使用阴离子交换固相100ml。

(3)洗脱分离：将步骤(2)获得的吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相采用盐溶液洗脱，收集洗脱液后纯化获得所述活性茯苓多糖。具体为：

利用不同浓度的氯化钠溶液为流动相进行洗脱，以1.0ml/min的流速用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，浓度范围0.4-0.7mol/l。

用苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线如图1所示。在0.5mol/l的氯化钠溶液1h54min-6h18min(保留时间)的范围和0.6mol/l的氯化钠溶液10h36min-12h24min(保留时间)范围收集相应的洗脱峰，分别浓缩、透析和冻干，得到活性茯苓多糖cmp-1和cmp-2，得率分别为62.80％和13.25％。

实施例2cmp-1和cmp-2的组分鉴定

cmp-1和cmp-2的总糖含量用苯酚硫酸法进行测定；蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定；糖醛酸含量用硫酸咔唑法测定；

cmp-1和cmp-2的化学组成如表1所示，cmp的总糖含量为79.88±1.02％，经deae-52纤维素分离得到的多糖cmp-1和cmp-2在总糖含量显著提高(p＜0.05)，但两者的多糖(总糖)含量之间无显著差异(p＞0.05)，分别为85.60±1.44％和84.52±2.43％，三者之间的糖醛酸含量无显著差异，分别为13.67±0.51％、12.24±0.76％和14.43±0.43％。此外，采用考马斯亮蓝法在两种多糖中均未检测出蛋白质。

表1cmp、cmp-1和cmp-2的基本组成成分表

注：不同字母代表差异具有显著性，p＜0.05

说明cmp、cmp1和cmp2的基本组成成分没有发生明显变化，都是酸性多糖。

实施例3红外光谱分析

如图2所示，在3418cm^-1处的宽吸收峰和2919cm^-1的吸收峰分别对应于o-h伸缩振动和c-h的伸缩振动，这两个峰为多糖的典型特征吸收峰；在1074cm^-1出现的强吸收峰为吡喃环醚键和羟基的特征吸收峰，在868cm^-1处有一吸收峰是β-末端异构的c-h振动的特征吸收峰，说明cmp-1和cmp-2为含有β糖苷键的吡喃环糖；1604cm^-1附近的吸收峰是c＝o的非对称伸缩振动，位于1424cm^-1处的吸收峰是-cooch3的c-h振动所产生，而位于1325cm^-1附近的吸收峰则是羧基的c＝o键振动所致，以上为羧甲基的特征吸收峰。

以上结果表明，与cmp相比，cmp-1和cmp-2的多糖特征官能团以及一级结构并没有发生改变。

实施例4cmp-1和cmp-2的分子量及高分子尺寸

sec-malls-ri(尺寸排阻色谱-激光光散射仪-示差检测器)：尺寸排阻色谱，也称凝胶色谱，其基本原理是依据高分子渗透进入多孔填料孔洞中的机率对其分子尺寸的依赖关系，得出高分子尺寸大小随保留时间或保留体积变化的曲线，即高分子分子量分布色谱图。

采用sec-malls-ri测量cmp的分子量及高分子尺寸。用dawnheleos-ⅱ激光光度计(he-nelaser,λ＝690nm,wyatttechnologyco.,santabarbara,ca,usa)，与凝胶色谱柱shodex-ohpaksb-804hq和保护柱ohpaksb-6g结合使用，流动相为含有0.02％nan3的0.1mnano3溶液，茯苓多糖样品完全溶解在流动相中达到1.0mg/ml的浓度，进样前过0.45微米滤膜。进样量为1ml，测试流速为0.4ml/min，测试柱温度为25℃，使用浓度为4.0mg/ml的葡聚糖标准液进行校准和归一化。使用astra6.1.2.84软件(美国怀亚特)进行分析。cmp、cmp-1、cmp-2在流动相中的ri曲线图的绘制结果如图3所示，表2为cmps的mw,mn,mw/mn,rz值。

表2cmp、cmp-1和cmp-2的高分子尺寸测定

在该系统下，具有不同分子量的组分通常以高分子量到低分子量的顺序被洗脱出来，我们可以看到cmp、cmp-1和cmp-2的出峰时间分别为12.996、14.360和14.141min,cmp、cmp-1和cmp-2的ri曲线图也均为一个单一的峰，说明三种多糖均一性很好。

实施例5cmp-1和cmp-2的空间结构鉴定

实验原理：一般而言具有三螺旋结构的多糖通常具有更好的生理活性，而具有三螺旋结构的多糖与刚果红溶液混合后在一定浓度的氢氧化钠溶液下会生成络合物使得刚果红混合溶液的最大吸收波长发生红移现象(即最大吸收波长变长)，而不具有三螺旋结构的多糖在同样条件下不具备相应的现象，因此刚果红实验可以用来评价多糖是否具备三螺旋结构。

将5mg多糖溶于2ml水中，加入2ml80μmol/l刚果红溶液，然后滴加1mol/l氢氧化钠，使混合溶液的最终氢氧化钠浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mol/l。用蒸馏水代替多糖溶液作为对照。用紫外分光光度计在400-800nm处扫描上述混合溶液并记录其最大吸收波长，结果如图4所示。

在0-0.2m氢氧化钠浓度下，相对于对照组(congored)，congored+cmp-1组和congored+cmp-1组的最大吸收波长均发生了很明显的红移现象，而cmp组的红移现象不明显，该结果说明经deae-52分离得到的cmp-1和cmp-2两种多糖均具有三螺旋结构，而cmp不具有明显的三螺旋结构。

cmp、cmp-1、cmp-2的透射电镜图片如图5所示。

由于tem的高分辨率，可用于观察大分子物质的内部精细，以及其在溶液中的形态和粒径大小。如图所示，在超纯水中，cmp呈棒状类结构，而cmp-1和cmp-2均呈现球状构象，cmp-1在超纯水中分散不均匀，其球体颗粒大小相差较大，且在溶液中大部分以聚集体的形式存在，并且粒径大于cmp-2。

以上结果显示：本发明制备的活性茯苓多糖在一级结构上没有发生变化，但在高级结构上发生了显著变化。

实施例6茯苓多糖活性鉴定

本发明茯苓多糖体外免疫调节活性研究

1、mtt实验测定cmp对raw264.7细胞存活率的影响

实验原理：mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)能够被活细胞体内的线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的结晶沉淀物，不能被死细胞还原，二甲亚砜能够溶解紫色沉淀物，其溶液在490nm处的吸光度值能反应活细胞的数量

取处于对数生长期raw264.7细胞以1×10^5个/ml每孔100ul细胞接种于96孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基；阳性对照组加入100ullps(1ug/ml)；实验组给予不同浓度(12.5-400ug/ml)的cmp、cmp-1和cmp-2溶液，继续培养24h，弃掉上清，加入100ul的mtt溶液，然后进一步温育4小时。吸出培养基后，向各孔中加入150uldmso以溶解甲瓒晶体，在490nm处测定其吸光度值。细胞活力＝(od实验-od空白)/(odcontrol-od空白)。

mtt实验是评价药物对实验细胞是否具有细胞毒性的关键实验，通过mtt可以筛选出安全计量进行后续实验，从图6可以cmp、cmp1和cmp2在12.5-400μg/ml浓度范围内不会抑制raw264.7细胞的生长，也就是说实验剂量下对该细胞没有毒性，相反三种多糖均能够显著促进巨噬细胞的增殖(p＜0.05)，cmp仅在某些剂量时才具有促进巨噬细胞增殖的作用，但其效果显著低于阳性对照组(149.48±9.31％)、cmp-1(最大增殖活性为50μg/ml时，190.86±9.13％)和cmp-2(最大增殖活性为25μg/ml时，177.81±7.65％)组。

2、cmp对raw264.7细胞分泌no的影响

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10^6个/ml接种于24孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基；实验组给予不同浓度的羧甲基茯苓多糖溶液，继续培养24h，分别取100ul于酶标板中，然后加入等量的griess试剂，室温静置30min后，于540nm处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中的亚硝酸盐(no^2-)含量。

no是免疫反应中重要的细胞因子，是一种反应性氮中间产物，属于具有氧化性能的自由基。少量的no便具有极强的杀伤力，能够病原体和肿瘤细胞等，可由被激活的巨噬细胞分泌。如图7所示，与正常对照组(control)相比，cmp不能促进raw264.7细胞分泌no，不具有明显的免疫调节活性，而经deae-52分离得到的两种多糖均能够显著的促进巨噬细胞分泌no，其中cmp-2的促进作用与阳性对照组lps相当，可达32.17±0.36μm。

3、cmp对raw264.7细胞吞噬中性红的影响

实验原理：中性红是一种活体细胞染料，其可以被巨噬细胞吞噬，并且巨噬细胞的吞噬能力不同所吞噬的中性红染料的量也不同，从而反映细胞的吞噬活性大小。因其操作简便，可以直接定量测定细胞的吞噬率，目前已成为一种快速筛选巨噬细胞吞噬能力大小的常用细胞模型。

取对数生长期细胞，以3×10^5个/ml每孔100μl细胞接种于96孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，按3.3.1分组处理细胞，处理24h后，弃掉上清，用预热的pbs小心清洗细胞2次，加入100μl的0.075％(w/v)的中性红溶液(用pbs配制)，然后进一步孵育0.5小时后小心弃掉培养基，用事先预热的pbs清洗3次，向各孔中加入200μl裂解液(无水乙醇：冰醋酸＝1:1)，室温下静置半小时待细胞完全裂解后在540nm处测定其吸光度值。吞噬指数＝(od实验-od空白)/(odcontrol-od空白)。

由于cmp不能促进细胞分泌no，无法进行raw264.7细胞吞噬中性红实验，只研究cmp-1和cmp-2对raw264.7的影响。从图8可以看出，用不同浓度范围的cmp-1和cmp-2处理细胞后，相对于正常组，均以剂量依赖型的方式显著促进巨噬细胞对中性红的吞噬作用，吞噬中性红的最大含量分别为273.68±4.74％和276.54±5.97％，高于lps组(158.42±5.46％)。

4、羧甲基茯苓多糖对细胞分泌细胞因子的影响

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10⁶个/ml接种于24孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基；实验组给予不同浓度的羧甲基茯苓多糖溶液，收集上清液2500r/min离心10min，取上清液按elisa试剂盒测定细胞上清中的细胞因子(tnf-α、il-6)的含量。

细胞因子的促生剂有效的调节相关细胞因子的分泌，被激活的巨噬细胞能够分泌细胞因子，启动机体的免疫反应，刺激免疫调节过程中一些介质的表达。如图9所示，与正常对照组相比，cmp-1和cmp-2均以剂量依赖性的方式促进巨噬细胞分泌tnf-α，两种多糖在最高浓度400μg/ml时，巨噬细胞分泌tnf-α的量达到最大，分别为355.61±1.09ng/ml和280.62±4.16ng/ml，均高于阳性对照组tnf-α的分泌量，并且cmp-1效果好于cmp-2。如图所示10，cmp-1可以剂量依赖性的方式促进il-6的分泌，cmp-2也可以显著促进巨噬细胞分泌il-6，cmp-1效果好于cmp-2。

本实施例制备的茯苓多糖，相对于羧甲基茯苓多糖、以及普通茯苓多糖具有相同的成分、官能团和一级结构，但是具有明显不同的高级结构，刚果红实验证实，本实施例制备的两种茯苓多糖具有明显的三螺旋结构，而未经离子交换固相吸附并洗脱的茯苓多糖不具备明显的三螺旋结构。透射电镜结果亦显示，茯苓多糖在吸附洗脱之前和吸附洗脱分离之后的物理形态发生了明显变化：未经吸附洗脱之前呈明棒状，吸附洗脱之后呈球形。以上结果均说明：本发明制备的茯苓多糖具有明显不同的高级结构。

而活性鉴定结果显示，本发明制备的茯苓多糖相对于普通茯苓多糖，能够极其显著的促进raw264.7细胞增殖、分泌no、吞噬作用，分泌细胞因子(tnf-α和il-6),表现出明显的免疫促进活性，与阳性对照相当甚至远超阳性对照，能够应用于制备免疫调节制剂。

实施例7

本发明茯苓多糖体内免疫调节活性研究

本实施例进一步证实羧甲基茯苓多糖在体内的免疫调节作用，首先利用环磷酰胺诱导小鼠免疫低下，然后给予一定剂量的cmp-1和cmp-2，通过细胞因子等指标评价羧甲基茯苓多糖的体内免疫调节活性。

1.实验方法

1.1免疫低下小鼠模型的建立

1.1.1实验原理

环磷酰胺是一种广谱类抗肿瘤药物，广泛用于多种癌症和自身性免疫病的治疗，会导致机体发生免疫抑制和氧化应激，高剂量的或长期低剂量的环磷酰胺可以导致机体免疫功能低下，主要表现在体重下降、器官异常、淋巴细胞增殖能力减弱、巨噬细胞吞噬能力降低，以及抗氧化酶活性下降等，因此常被用于建立免疫低下动物模型。

1.2实验方法

1.2.1动物处理

50只雌性的昆明小鼠先适应性培养一周，第8-10d时除正常对照组外均连续腹腔注射80mg/kg.bw/d环磷酰胺，模型组注射等量的生理盐水，第11-20天按200mg/kg.bw/d的剂量灌香菇多糖则剂量为，cmp组、cmp-1组和cmp-2组按200mg/kg/d的剂量分别灌胃cmp和cmp-1和cmp-2，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水。末次给药后24h小鼠禁食，摘眼球取血后颈椎脱臼法处死小鼠，并解剖收集小鼠脏器(胸腺、脾脏、肝脏、心脏、肾脏)并称重。实验期间记录小鼠体重，饮食量和饮水量。

1.2.2cmps对小鼠血清中细胞因子含量的影响

所有受试动物给药结束之后，空腹过夜收集眼眶静脉窦的血样，样品于4℃下1000r/min离心10min获得血清收集于无菌离心管中于-20℃保存备用。按照试剂盒说明书测定血清中tnf-α细胞因子的含量。

2.实验结果及分析

如图11所示，与正常对照组相比，ctx(环磷酰胺)组小鼠血清中细胞因子tnf-α含量显著下降，表明该免疫低下模型建立成功，而经过七天灌胃香菇多糖(对应阳性对照组)和cmp后，血清中细胞因子tnf-α含量显著提高，但仍低于正常小鼠血清中tnf-α水平，而经过七天灌胃cmp-1和cmp-2后小鼠血清中的细胞因子恢复正常水平。

实施例8

本实施例提供的活性茯苓多糖按照如下方法制备：

(1)制备羧甲基茯苓多糖水溶液：提取茯苓多糖并进行羧甲基化，获得羧甲基茯苓多糖，并溶解在水中获得羧甲基茯苓多糖水溶液；所述羧甲基茯苓多糖浓度在10mg/ml，所述羧甲基茯苓多糖的取代度在0.6-0.7。

所述羧甲基茯苓多糖优选按照如下方法制备：

取1kg过100目筛的茯苓粉，加入5.0l85％乙醇在室温下搅拌溶胀30min，再加入0.3～0.5kg的氢氧化钠(用少量乙醇溶解)在50℃下搅拌碱化0.5～1.0h。然后再加入0.3～0.5kg氢氧化钠(用少量乙醇溶解)和0.8～1.0kg氯乙酸，在50～70℃温度条件下醚化3.0h。反应完毕后，用体积分数80％的乙醇洗涤4次，除去多余氯离子。在40～50℃下干燥7～10h，干燥，过80目筛，得到取代度为0.7左右的羧甲基茯苓多糖粉。所得白色粉末即为羧甲基茯苓多糖粉。

d·s按照灰碱法测定，测定方法如下：将已充分干燥后的改性产品连同瓷埚锅放进高温炉，700±25℃灼烧30min，冷却后先用少量水润湿含有焦粒的灰白粉末，然后洗移至烧杯中(总量不超150ml)，加入甲基红指示剂3滴，用0.05mol/lh2so4滴到显红色后，再从滴定管放入10ml，记下h2so4总用量a，将溶液放在电炉上加热，使之轻轻沸腾10min，不必冷却，即用0.1mol/l的naoh溶液滴定至变黄色为止，记下其用量b。计算公式:

取代度(d·s)＝0.162b/(l－0.08b)

b＝(a*nl－b*n2)/w

a一硫酸标准溶液用量(ml)

b一氢氧化钠标准溶液用量(ml)

nl一硫酸标准溶液当量浓度(0.05mol/l)

n2一氢氧化钠标准溶液当量浓度(0.lmol/l)w一样品重量(g)

本发明制备的cmp的取代度(d·s)＝0.705

将200mg羧甲基茯苓多糖(cmp)溶解于20ml蒸馏水中，形成羧甲基茯苓多糖水溶液。

(2)离子交换吸附：使步骤(1)获得的羧甲基茯苓多糖水溶液与阴离子交换固相充分接触，获得吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相；具体为：

将步骤(1)制备的羧甲基茯苓多糖水溶液与粒径在50um的deae-52，慢速轻柔搅拌混合60min，每30mg羧甲基茯苓多糖使用阴离子交换固相100ml；然后静置过滤，获得吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相。

(3)洗脱分离：将步骤(2)获得的吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相采用盐溶液洗脱，收集洗脱液后纯化获得所述活性茯苓多糖。具体为：

将步骤(2)获得的吸附有羧甲基茯苓多糖的阴离子交换固相加入150ml0.6mnacl溶液用磁力搅拌器轻轻搅拌30min后，采用静置过滤的方法收集150ml滤液后，重复上述操作2次，合并收集液进行浓缩、透析并冻干，得到活性茯苓多糖cmp-3。

cmp3对raw264.7细胞分泌no的影响

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10^6个/ml接种于24孔板中，于37℃5％co2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100uldmem基础培养基；实验组给予不同浓度的cmp3，继续培养24h，分别取100ul于酶标板中，然后加入等量的griess试剂，室温静置30min后，于540nm处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中的亚硝酸盐(no^2-)含量。

no是免疫反应中重要的细胞因子，是一种反应性氮中间产物，属于具有氧化性能的自由基。少量的no便具有极强的杀伤力，能够病原体和肿瘤细胞等，可由被激活的巨噬细胞分泌。如图12所示，与正常对照组(control)相比，cmp-3组可显著促进no产生，表现出免疫调节作用，与实施例1制备的cmp-1和cmp-2混合物相当。

透射电镜亦显示cmp-3在超纯水中呈球状结构，说明其高级构象发生了与实施例1的cmp-1和cmp-2相同的变化。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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