一种油茶粕多糖的提取方法及其应用与流程

本发明涉及多糖提取和应用技术领域，尤其涉及一种油茶粕多糖的提取方法及其应用。

背景技术：

油茶饼是油茶籽经榨油后的饼状残渣。在油茶的一系列生产过程中，人们往往忽视了处理后的副产品油茶粕残渣，其价值较高，营养成分丰富，产量远远高于油茶。据研究发现，油茶粕中含有一定量的水溶性多糖，具有一定的保健作用和药用价值。

植物水溶性多糖的提取方法众多，所需实验仪器和消耗经济成本因方法而异。目前提取植物多糖的方法中传统水提醇沉法、酶解超声辅助法这两种方法操作简单，反应条件温和，实验难度低，但需等待时间长；冻融辅助提取法提取多糖的操作亦简单，细胞破壁方式温和，由于实验过程中并未用到热水浸取多糖，可避免高温造成营养成分损失，可保证经济效益，但需在-80℃中冷冻12h，且需重复操作至少3次，因此整个实验消耗时间较长；亚临界水提取法提取率较传统提取方法高，且较少溶剂杂质残留，对环境污染小，后处理简单。目前关于油茶柏多糖的提取方法非常少。

可食性复合保鲜膜是以天然可食性物质(如多糖、蛋白质、脂类等)为材料，添加可食性的增塑剂、交联剂等，通过不同分子间的相互作用，并以浸涂、涂膜等形式覆盖于食品表面(或内部)，形成起保护作用的薄层，以阻隔水气、氧气或各种溶质的渗透。油茶粕中含有茶皂素、多糖、蛋白等多种功能成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌等多种活性，有极大的开发利用的潜力。然而，目前油茶粕一般用于动物饲料，清塘剂、燃料等，甚至废弃，造成资源的极大浪费。因此，使油茶粕变废为宝、对油茶粕进行深加工成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的问题和不足，本发明提供一种油茶粕多糖的提取方法及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种油茶粕多糖的提取方法，包括以下步骤：

s1.原料预处理：将油茶饼粕原料粉碎并过80目筛，然后在烘箱中烘干，得到油茶饼粕粉末；

s2.脱脂：将步骤s1制备得到的油茶饼粕粉末进行脱脂处理，然后在烘箱中烘干，备用；

s3.去除茶皂素：将步骤s2脱脂烘干后的油茶饼粕粉末用85％的乙醇浸提，然后用抽滤装置将渣液分离，将渣置于烘箱中烘干，备用；

s4.提取多糖：将步骤s3烘干得到的粉末装入耐压反应瓶中，采用亚临界水提法提取油茶粕多糖；反应结束后取出耐压反应瓶冷却至室温，离心后取上清液；将沉淀再次用相同的方法提取，合并两次上清液并进行浓缩，得到油茶粕多糖粗提液；

s5.后处理：将步骤s4得到的油茶粕多糖粗提液进行脱蛋白、醇沉，然后冷冻、干燥，得到油茶粕多糖成品。

进一步地，步骤s2采用索式提取法进行脱脂处理，加入的有机溶剂为石油醚，反应温度为75℃，且持续时间为6h。

进一步地，步骤s3中粉末与加入乙醇的料液比为1:20g/ml，浸提温度为45-85℃，时间为1-4h。

进一步地，步骤s3在乙醇浸提后还采用超声波辅助去除茶皂素，温度为50℃，时间为25min。

进一步地，步骤s4中粉末与亚临界水的料液比为1:10-1:30g/ml。

进一步地，步骤s5中采用sevage法进行脱蛋白，且所述油茶粕粗提液与sevage试剂的体积比为4:1-6:1。该方法较为温和，且对多糖的结构影响不大。

更进一步地，所述sevage试剂为预先配制的氯仿和正丁醇混合液，且体积比为4:1。

本发明还包括一种油茶粕多糖保鲜膜，由以下重量份的原料组成：甘油0-5份，高酰基结冷胶0.5-2.5份，普鲁兰多糖0-2份，水适量；油茶粕多糖占保鲜膜总重量的0-20％，且所述油茶粕多糖由权利要求1-7提取得到的多糖进行脱色后得到。

所述油茶粕多糖保鲜膜的制备方法为：将脱色后的油茶粕多糖与甘油、高酰基结冷胶、普鲁兰多糖按照所述重量比混合添加到水中，在90℃温度下不断搅拌至完全溶解得到复合保鲜膜液，然后倒入无菌培养皿冷却凝固，即得到油茶粕多糖保鲜膜。

本发明还包括所述油茶粕多糖保鲜膜在鸡肉保鲜中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明所述油茶粕多糖的提取方法，提取得率高、工艺简单，有一定的抗氧化性和广谱抑菌性，更便于其高附加值产品的开发。

2、本发明所述油茶粕多糖保鲜膜为天然的可食性复合保鲜膜，可以延长新鲜鸡肉的保质期，在5℃下经过12天，鸡肉仍然符合一级鲜肉质量指标。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是葡萄糖标准曲线。

图2是油茶粕多糖对dpph·自由基的清除率。

图3是油茶粕多糖提取液添加量对tvb-n值和菌落总数的影响。

图4是油茶粕多糖提取液添加量对ph值的影响。

图5是成膜剂添加量对tvb-n值和菌落总数的影响。

图6是成膜剂添加量对ph值的影响。

图7是甘油添加量对tvb-n值和菌落总数的影响。

图8是甘油添加量对ph值的影响。

图9是普鲁兰多糖添加量对tvb-n值和菌落总数的影响。

图10是普鲁兰多糖添加量对ph值的影响。

具体实施方式

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1

油茶粕多糖的提取

1.1材料试剂与设备

1.1.1材料与试剂

油茶籽饼，由广东友丰油茶科技有限公司提供；

表1试验所用试剂一览表

试验菌种：大肠杆菌(escherichiacoli，革兰氏阴性菌g-)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，革兰氏阳性菌g+)、酵母菌(soccharomycsescerevisiaehansen)、黑曲霉(aspergillusniger)、根霉(rhizopus)由韶关学院英东生命科学与工程学院微生物实验室提供。

培养基：酵母膏胨葡萄糖(ypd)琼脂培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；马铃薯培养基，自制；

细菌培养基：营养琼脂(nutrientagar)称取33克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装121℃高压灭菌15分钟，备用；

霉菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(pda)称取37克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装121℃高压灭菌15分钟，备用。

1.1.2仪器与设备

表2试验所用设备表

2.2实验方法

2.2.1实验步骤

s1.原料预处理：将油茶饼粕原料粉碎并过80目筛，然后在烘箱中烘干，得到油茶饼粕粉末；

s2.脱脂：将步骤s1制备得到的油茶饼粕粉末进行脱脂处理，采用索式提取法进行脱脂处理，加入的有机溶剂为石油醚，反应温度为75℃，且持续时间为6h，然后在烘箱中烘干，备用；

s3.去除茶皂素：将步骤s2脱脂烘干后的油茶饼粕粉末用85％的乙醇浸提，粉末与加入乙醇的料液比为1:20g/ml，浸提温度为45-85℃，时间为1-4h；在乙醇浸提后还采用超声波辅助去除茶皂素，温度为50℃，时间为25min；然后用抽滤装置将渣液分离，将渣置于烘箱中烘干，备用；

s4.提取多糖：将步骤s3烘干得到的粉末装入耐压反应瓶中，采用亚临界水提法提取油茶粕多糖，其中粉末与亚临界水的料液比为1:10-1:30g/m；反应结束后取出耐压反应瓶冷却至室温，离心后取上清液；将沉淀再次用相同的方法提取，合并两次上清液并进行浓缩，得到油茶粕多糖粗提液；

s5.后处理：将步骤s4得到的油茶粕多糖粗提液进行脱蛋白、醇沉，然后冷冻、干燥，得到油茶粕多糖成品；本实施例中采用sevage法进行脱蛋白，所述sevage试剂为预先配制的氯仿和正丁醇混合液，且体积比为4:1；所述油茶粕粗提液与sevage试剂的体积比为4:1-6:1。

2.2.2操作要点

(1)脱脂：将收集到的油茶饼粕原料用万能粉碎机粉碎成粉末(万能粉碎机操作过程：将饼状原料碎块放入粉碎机不超过2/3，盖上盖子，拧紧两边螺丝，手握盖子，打开电源，转动开关至1档左右，转动2-3秒后停止2s左右，继续打开开关，重新5-6次，直至粉碎机声音柔和，关掉电源，打开盖子)，之后将初步粉碎的油茶饼粕过80目筛，放入烘箱烘2h,温度60℃，将入封口袋备用。称取处理后的15g油茶粉末，进行脱脂使用的是索氏提取装置(脂肪提取器)，温度75℃。6h后取出样品，打开滤纸，在60℃烘干箱内烘干2h，备用。

(2)茶皂素的提取：称取脱脂烘干后的油茶饼粕15g，用85％的乙醇用料液比1：20浸提，温度80℃，时间1h。浸提完成后用超声波辅助提取茶皂素，温度50℃，时间25min。清洗完成后用抽滤装置将渣液分离，将渣置于60℃烘箱烘干2h得脱除茶皂素后的油茶饼粕粉末，备用。用旋转蒸发仪将抽滤后的液体蒸发浓缩，冷冻干燥后即得茶皂素粗产品具体3.39g。

(3)亚临界水体法提取：取10g脱脂、脱除茶皂素干燥油茶饼粕粉末，放入耐压反应瓶中，加200ml蒸馏水，放入转子封口，将反应瓶放入磁力搅拌油浴锅中，120℃提取30min，利用亚临界水提取油茶粕多糖，反应结束后取出耐压反应瓶冷却至室温，离心(4000r/min、5min)，取上清液，而沉淀再次同条件提取，合并两次上清液进行浓缩、sevage法去蛋白、醇沉及冷冻干燥、称重。

2.2.3葡萄糖标准曲线绘制及回归方程

将0.1mg/ml葡萄糖对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml精密测定于25ml容量瓶中。通过依次添加去离子水，最终定容体积为1.0毫升。空白对照组为1ml。采用490nm波长分光光度法测定其吸收值。(因定容体积为1ml，所以可直接作出葡萄糖质量-吸收值曲线)。以葡萄糖质量，吸收值作为标准曲线。得线性回归方程为:y＝0.6386x-0.0174(y:吸光度，x:糖浓度)。r＝0.9965，线性范围0.0～1.0mg/ml。

2.2.4油茶粕多糖提取率的计算

油茶粕多糖提取率的计算公式式中:w为油茶粕多糖的提取得率％，m为经回归方程计算得出的油茶粕多糖质量，g：m0为样品质量，g；

经计算，本实施例方法提取得到的油茶粕多糖的提取率为64.30％。

3.1油茶籽粕多糖抑菌性试验

3.1.1菌悬液的制备

分别对各菌种进行接种，常规培养至三代备用。取培养后的细菌原液，采用10倍稀释法稀释，各浓度分别做两个平行实验。采用平板菌落计数法，培养后计算各培养皿的菌落，得最佳供试菌液浓度为10³cfu/ml。

3.1.2油茶粕多糖抑菌圈测定

用无菌移液管将0.2毫升的细菌悬液转移到倒好的平板上。悬浮液均匀地涂上一层涂层并保留下来。每种菌株制备两个平板。在每个营养板中加入四片滤纸，将滤纸压平。将茶粉多糖溶液浸泡在每个培养皿的两个滤纸上。另外两片滤纸分别作为阳性对照管和阴性对照管，阳性对照管只含有相同量的细菌溶液，阴性对照管既不含多糖溶液也不含细菌溶液。酵母和霉菌培养皿在28℃培养48小时，细菌培养皿在37℃培养24小时。测定其抑菌圈的大小，判断其活性取决于抑菌圈的大小。大抑菌圈表明多糖具有较强的抑菌活性，小抑菌圈表明多糖的抑菌活性较弱。

3.1.3油茶粕多糖的最小抑菌浓度(mic)的测定

采用梯度稀释平板培养计数法。在牛肉提取物蛋白胨液体培养细菌，酵母和黑曲霉在马铃薯液体培养基中培养。将每株供试品系分别取1毫升(10⁴cfu)接种于体积分数为4.0％、2.0％、1.0％、0.5％、0.25％、0.12％、0.06％、0.03％、0.015％油茶粉多糖溶液的液体培养基试管(三个平行样品)中。充分摇匀后，细菌在37℃培养24小时，酵母和黑曲霉在30℃培养48小时。培养后，明显的混浊试管显示细菌已经生长，培养观察时滴入0.1ml样品，每个梯度重复三次。

3.1.4抑菌实验结果

油茶粕多糖对供试菌种抑菌活性见表3。

表3油茶粕多糖对供试菌种抑菌活性

由表3可知，油茶粕多糖对酵母菌的抑菌作用最大，对黑曲霉、大肠杆菌的抑菌作用次之，对金黄色葡萄球菌作用最小，抑菌圈大小分别为22.73±0.02mm、19.62±0.03mm、13.85±0.02mm、11.25±0.03mm，最小抑菌浓度分别为0.14％、0.39％、0.52％、0.67％。油茶粕多糖即能抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，又能抑制革兰氏阴性菌，具有广谱抑菌性。

4.1油茶粕多糖对dpph·自由基清除能力测定

将多糖母液稀释到浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、mg/ml，取每2ml的各浓度样液，分别加入2ml2×10^－4mol/l的dpph乙醇溶液摇匀后，在室温下静置反应30min，在517nm处测定吸光值ai，以等体积的无水乙醇代替dpph·自由基溶液作为空白组，以等体积的蒸馏水代替多糖溶液作为对照组，并以vc为阳性对照。

对dpph·自由基的清除率计算公式：清除率/％＝(1－(ai－aj)/ao)×100，式中：ao为对照组吸光值，ai为样品组吸光值，aj为空白组吸光值。以各样液浓度为横坐标，dpph·自由基淸除率为纵來标，做出相关曲线，并计算出半抑制浓度ic50，此值含义为dpph·自由基抑制50％时的多糖浓度，值越小，活性越强。

4.2油茶粕多糖抗氧化活性

由图2可知，油茶粕多糖对dpph·自由基清除能力随着油茶粕多糖浓度增大而增强，他们之间存在一定的线性关系。清除能力弱于抗坏血酸(vc)，油茶粕多糖对dpph·的清除能力ic50为983.540±21.972μg/ml，vc的ic50为314.246±13.340μg/ml。油茶粕多糖有一定的抗氧化活性，但弱于抗坏血酸(vc)。

综上，本实施例所述油茶粕多糖的提取方法，提取得率高、工艺简单，有一定的抗氧化性和广谱抑菌性，更便于其高附加值产品的开发。

实施例2

油茶粕多糖保护膜的制备及应用

1.1实验材料

油茶粕多糖，由实施例1制备得到；

新鲜鸡肉，购于韶关学院北区菜市场；

1.2实验试剂

表4实验试剂

1.3仪器与设备

表5仪器与设备

2.1制备方法

2.1.1制备工艺流程

将实施例1得到的油茶粕多糖进行脱色，然后与甘油、高酰基结冷胶、普鲁兰多糖按照所述重量比混合添加到水中，在90℃温度下不断搅拌至完全溶解得到复合保鲜膜液，然后倒入无菌培养皿冷却凝固，即得到油茶粕多糖保鲜膜。

2.2.2操作要点

(1)油茶粕多糖脱色：在实施例1得到的油茶粕多糖中按料液比1:15加入蒸馏水于75℃下浸提2h，然后过滤取清液；接着加入3％的颗粒活性炭-白土混合脱色剂(颗粒活性炭占其中的10％，在70℃水浴25min；最后在3500r/min转速下离心20min，上清液即为脱色的油茶粕多糖提取液。

(2)添加物混合：高酰基结冷胶具有良好的热稳定性，不溶于冷水，所以混合的时候要置于电炉上一边加热一边搅拌均匀。

2.2油茶粕多糖保鲜膜的单因素实验

2.2.1分析测定方法

购买新鲜鸡胸肉，用消毒过的刀具清理鸡肉上多余的脂肪和筋络，切分为20g每小块，涂膜复合保鲜液后放入放进冰箱4℃保存，5d后取出抽取样品进行分析测定。

2.2.2测定指标

保鲜膜保鲜鸡肉的效果评价参照一级鲜肉的标准(细菌总数≤10⁶，tvb-n值≤15mg/100g，ph5.18-6.12)，以挥发性盐基氮(tvb-n值)、ph值、菌落总数为考察指标。

2.2.2.1菌落总数的测定

按照gb/t4789.2-2016规定方法测定。其评定标准为一级鲜肉细菌总数≤10⁶，二级鲜肉10⁶＜细菌总数≤10⁸，变质肉细菌总数＞10⁸。

2.2.2.2挥发性盐基氮的测定

按照gb/t5009.228-2016规定方法测定，采取半微量定氮法测定，其评价标准为：一级鲜度≤15mg/100g,二级鲜度≤25mg/100g,变质肉>25mg/100g。

2.2.2.3ph值的测定

将鸡肉切碎并浸泡在100ml蒸馏水中并过滤，然后用ph计测量鸡肉碎滤液的ph值。ph值可以表示肉的新鲜度标准：ph5.18-6.12为一级鲜度,ph6.13-6.16为二级鲜度，ph6.17以上为变质肉。

2.2.3油茶粕多糖提取液添加量对鸡肉保鲜的影响

取0.3g甘油，高酰基结冷胶0.15g，普鲁兰多糖0.1g，油茶粕多糖提取液添加量分别为0％、5％、10％、15％、20％，加去离子水至30ml，在90℃下，不断搅拌至完全溶解得到复合保鲜膜液，然后倒入无菌培养皿冷却凝固，包裹鸡肉,贮存在5℃环境下，5天后，分析鸡肉的t-vbn值、ph值、菌落总数值，确定油茶粕多糖提取液最适添加量。

由图3-4可知，油茶粕多糖提取液的添加量为15％的时候，tvb-n值和菌落总数值最小，即新鲜程度最好，抑菌效果也最好。同时，油茶粕多糖提取液的添加量为15％的时候，ph为5.33，属于一级鲜肉范围。

2.2.4高酰基结冷胶(成膜剂)添加量对鸡肉保鲜的影响

甘油添加量0.3g，油茶粕多糖提取液15％，普鲁兰多糖0.1g，高酰基结冷胶添加量分别为0.05g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g，其余操作同2.2.3，确定高酰基结冷胶最适添加量。

由图5-6可知，当成膜剂添加量为0.2g时，菌落总数达到最小值，ph值为5.24，属于一级鲜肉范围。当成膜剂添加量为0.25g时，tvb-n值最小。但是由于当成膜剂添加量为0.25g时，膜液里会含有未能完全溶解的颗粒，影响成膜效果，故选择成膜剂添加量为0.2g。

2.2.5甘油添加量对鸡肉保鲜的影响

油茶粕多糖提取液15％，高酰基结冷胶0.15g，普鲁兰多糖0.1g，甘油添加量分别为0g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g，按2.1的工艺流程制备保鲜膜，其余操作同2.2.3，确定甘油最适添加量。

由图7-8可知，当甘油的添加量为0.4g时，tvb-n值和菌落总数值达到最小值，此时抑菌效果最好。当甘油的添加量为0.3g时，ph值为5.33，属于一级鲜肉范围，但是甘油添加量为0.4g时，菌落总数值有减少，此时的ph值为5.41，同样属于一级鲜肉范围，因此选择甘油的添加量为0.4g。

2.2.6普鲁兰多糖添加量对鸡肉保鲜的影响

甘油添加量0.3g，油茶粕多糖提取液15％，高酰基结冷胶添加量0.15g，普鲁兰多糖添加量分别为0g、0.05g、0.10g、0.15g、0.20g，按2.1的工艺流程制备保鲜膜，其余操作同2.2.3，确定普鲁兰多糖最适添加量。

从图9-10可以看出，当普鲁兰多糖的添加量为0.15g时，tvb-n值和菌落总数值达到最低，此时新鲜度最好，抑菌效果最好。此时，ph值为5.33，属于一级鲜肉范围，因此普鲁兰多糖的添加量选择0.15g。

2.3油茶粕多糖保鲜膜的正交优化实验

由图3、图5、图7、图9看出，ph值变化对保鲜膜保鲜效果影响不明显，因为不管油茶粕多糖提取液、成膜剂、甘油及普鲁兰多糖的添加量增大还是减少，包膜后的新鲜鸡肉ph值基本皆在4～6内，没有超过一级鲜肉规定的范围值，因此可忽略这四种添加物对鸡肉ph值的影响。所以下面的正交实验中以tvb-n、菌落总数为考察指标。

成膜液为去离子水，规定为30ml。以油茶粕多糖添加量、成膜剂高酰基结冷胶添加量、甘油的添加量、普鲁兰多糖的添加量为自变量，设计四因素三水平l9(3⁴)的正交优化实验。因素水平表见表3。

表6l9(3⁴)正交实验因素水平设计表

结果如表7所示，以tvb-n值(mg/100g)来看，影响的主次因素顺序为：a>d>c>b，以油茶粕多糖提取液的添加量的影响为显著，其次是普鲁兰多糖，再为甘油的添加量，影响最小的为成膜剂的添加量。最优组合为a2d2c3b1(油茶粕多糖提取液添加量为15％，普鲁兰多糖添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4g，成膜剂的添加量为0.15g)；从菌落总数(cfu/g)来看，影响的主次因素顺序为a>d>c>b，以油茶粕多糖提取液的添加量的影响为显著，其次是普鲁兰多糖，再为甘油的添加量，影响最小的为成膜剂的添加量。最优组合为a3d2c3b2(油茶粕多糖提取液的添加量为20％，普鲁兰多糖的添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4g，成膜剂的添加量为0.2g)。

表7复合膜保鲜工艺优化l9(3⁴)正交实验结果分析表

由表8可知，油茶粕多糖的添加量对鸡肉tvb-n值有显著影响。

表8以tvb-n值为指标的正交实验方差分析表

由表9可知，油茶粕多糖的添加量对鸡肉菌落总数有显著影响。

表9以菌落总数为指标的正交实验方差分析表

2.4验证实验

由2.3可知，油茶粕多糖保鲜膜配方最优组合为a2d2c3b1和a3d2c3b2，每组组合分别做三次平行实验。以tvb-n值和菌落总数为考察指标，在4℃条件下贮藏12d，最终选择保鲜效果最好的一组为最优组合。a2d2c3b1(油茶粕多糖添加量为15％，普鲁兰多糖添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4g，成膜剂的添加量为0.15g)为实验组1，a3d2c3b2(油茶多糖的添加量为20％，普鲁兰多糖的添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4g，成膜剂的添加量为0.2g)为实验组2。

由表10可知，实验组2保鲜效果好。故油茶粕复合保鲜膜配方为：油茶多糖的添加量为20％，普鲁兰多糖的添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4g，成膜剂的添加量为0.2g。

表10验证实验比较分析表

注:a2b1c3d2为实验组1，a3b2c3d2为实验组2。

综上，油茶粕多糖保鲜膜最佳配方为：油茶多糖提取液添加量为20％，高酰基结冷胶添加量为0.2g，甘油添加量为0.4g，普鲁兰多糖添加量为0.15g，可以使新鲜鸡肉在5℃下经过12天，仍然符合一级鲜肉质量指标。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

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