一种耐高温的总状毛霉及其应用的制作方法

2021-02-02 18:02:23|

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本发明涉及一株耐高温的总状毛霉及其应用，具体涉及一株耐高温总状毛霉m-thf-02及其应用，属于微生物发酵技术应用领域。

背景技术：

毛霉菌（mucor）是腐乳、豆豉等发酵制品常用的菌种，可以分解大豆制品里的大豆蛋白，具有糖化淀粉、与降解纤维素的能力。由于毛霉菌长期在高蛋白的环境条件下进行了驯化，因而具有了合成以及分泌多种胞外蛋白酶的能力，其胞外蛋白酶系由多种不同类型的蛋白酶构成复杂的体系，同时产生纤维素酶系、果胶酶系等形成复合酶系统，催化多种生物化学反应，使发酵产物具有独特的营养保健功能。

最常用在豆豉发酵中的毛霉是总状毛霉与鲁氏毛霉。总状毛霉所分泌的蛋白酶和肽酶可以将大豆中的大豆蛋白降解生成胨、多肽和游离氨基酸；所分泌的α-淀粉酶，可以作用于豆豉中少量的淀粉，使淀粉发生糖化作用，从而赋予了豆豉丰富的营养和风味。总状毛霉还可以分泌一种儿茶酚氧化酶具有催化黄酮类物质转化的作用，将豆豉中无色的黄酮类物质催化转化成一种黄色的羟基化合物，正是这种黄色的羟基化合物使成熟的豆豉呈现出诱人的有增进食欲的亮黑色，以及纯正的清香气味。

但是目前对于毛霉豆豉的规模化生产而言，其工业技术还相对的落后，主要原因是菌种不纯、不耐高温、酶活力低、制曲周期长。现在毛霉豆豉生产一般采用的是自然接种，菌种杂而不纯，无法保障品质稳定和食品安全，且不利于工业化生产。毛霉豆豉生产一般选在气温低的冬季生产，传统的毛霉豆豉适宜生产环境温度在10-15℃，该温度条件严重限制了毛霉豆豉的生产期和产能发挥；毛霉的酶活力相对于曲霉等要低得多，其中起主要作用的酸性蛋白酶酶活力一般只有200u/100g左右，因酶活力低，导致发酵周期较长，一般在12个月左右，该因素严重限制了毛霉豆豉的工业化产量；毛霉的生长速度与曲霉比较也要缓慢得多，一般自然接种毛霉生产豆豉，制曲周期在7-10天，该因素也限制了毛霉豆豉的工业化生产推广。综上因素导致了毛霉豆豉不能进行周年生产，通常选择在气温较低的冬季进行制曲，很难做到标准化的品质稳定生产，产量和效益一致无法得到有效提升，限制了毛霉豆豉生产的工业化、标准化和规模化发展。

另外，由于毛霉菌丝的粘连度较高，导致制曲曲料厚度不易过厚，自然接种生产毛霉豆豉一般采用簸箕制曲，其料层厚度在3-5cm，即使采用条池通风制曲，其料层厚度也难以超过20cm。

因此筛选一株耐高温、产蛋白酶高、代谢能力较强、品质稳定优良，适合工业化圆盘制曲，且在发酵厚度20-30cm也能正常发酵的菌株是非常必要的，从而使毛霉型豆豉由作坊式生产向工业化、标准化生产的转型提供依据。

技术实现要素：

基于上述分析，本发明提供了一株耐高温、产蛋白酶高，代谢能力较强，品质稳定优良，适合工业化圆盘制曲，且在制曲料层20-30cm也能正常发酵的总状毛霉株。

本发明是通过如下手段实现的：

一种耐高温的总状毛霉（mucorales）m-thf-02，所述总状毛霉于2020年9月14日保藏至位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：m2020552保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

进一步的，本发明还公开了上述总状毛霉m-thf-02分离筛选自四川太和牌豆豉曲料。

进一步的，本发明还公开了上述总状毛霉m-thf-02耐受温度为28-30℃。

进一步的，本发明还公开了上述任一总状毛霉m-thf-02在大豆发酵制品中的应用。

进一步的，上述大豆发酵制品包括但不限于豆豉，酱油，大豆酱。

进一步的，上述应用包括如下步骤：

（1）斜面培养：所述总状毛霉m-thf-02在无菌的条件下接入pda斜面培养基，28℃下培养48-72h，得斜面菌株；

（2）发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，得到种子培养液；

（3）前发酵：取熟化的黄豆，接种步骤（2）中收获的菌种孢子后进行前发酵，在28-30℃进行制曲，温度不超过32℃，制曲时间为48-72h，相对湿度控制在90-95%；

（4）后发酵：将制曲后豆豉添加食用盐等调味料，常温下自然发酵，每隔30d测定豆豉的氨基态氮、总酸、含盐量。

进一步的，步骤（1）所述斜面菌株由如下方法制得：

s1：将总状毛霉m-thf-02在无菌的条件下接入pda斜面培养基在28℃培养48-72h，待斜面培养基上长满毛霉孢子后在0-4℃保存备用；

s2：在无菌的条件下，用接种环钩取毛霉试管原种1~2环，接种于500ml的三角瓶的培养基中，塞好棉塞，充分振荡制成二级菌种；

s3：将豆渣与米粉1:1混合拌匀后分装于干燥的敞口瓶中，封闭瓶口，置于蒸料池中，常压整料60min后取出；

s4：将上述原料取出后充分振荡摇匀并冷却2-3h，取二级菌种于三角瓶中充分震荡，用无菌水2:3的比例稀释，使孢子的含量为105~106cfu/ml，用灭菌的注射器吸取稀释液，每瓶接种量为8-10ml，最后震荡摇匀，置于28℃静置培养48-52h，待培养基长满毛霉孢子；

s5：从敞口瓶中取出毛霉孢子，置于灭菌的簸箕中，按1：3（豆豉毛霉1；米粉3）加入烘干米粉，充分混匀，置于保存室中晾摊保存，室温保存控制在18℃。

进一步的，步骤（3）所述熟化黄豆由如下方法制得：

将优质黄豆加入30℃-35℃温水中浸泡1.5h，浸泡水位淹过黄豆30cm，然后在121℃高压蒸煮20-25min。

进一步的，步骤（3）所述前发酵为：熟化黄豆冷却至室温，取三级菌种0.5%-1.0%与熟化黄豆拌匀，在28-30℃进行制曲，温度不超过32℃，制曲时间为48-72h，相对湿度控制在90-95%。

进一步的，步骤（4）所述调味料为：添加8%-10%的食盐，2.5%-5%的白酒。

本发明的有益效果在于：

1、本发明得到的总状毛霉m-thf-02，最适的生长温度在28-30℃，具有耐高温、且产蛋白酶高的能力，克服了传统毛霉不耐高温的问题，且应用于豆豉的生产中能显著提高豆豉成曲的酶活力，缩短豆豉的制曲时间和后发酵时间，提高生产效率，确保了产品质量的稳定与安全，减少企业的资金压力；另一方面该菌种能够四季进行生产，可以有效的提高企业的经济效益。

2、本发明得到总状毛霉m-thf-02，与现有工业化生产的毛霉豆豉曲料厚度在15-18cm的总状毛霉相比，总状毛霉m-thf-02仍能在圆盘制曲发酵厚度为30cm时赋予豆豉浓郁的酱香、豉香、鲜香，优良的色泽、其产品口感醇厚，滋味鲜美。

生物材料保藏信息：

总状毛霉（actinonmucorelegant）m-thf-02，于2020年9月14日保藏至位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：m2020552，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明分离的总状毛霉m-thf-02应用至毛霉豆豉的生产技术路线图。

图2为两种总状毛霉的菌落形态图，其中a表示目标总状毛霉m-thf-02，b表示生产用总状毛霉。

图3为两种总状毛霉的生长速率图，其中a表示目标总状毛霉m-thf-02，b表示生产用总状毛霉。

图4为本发明分离的总状毛霉m-thf-02的its扩增产物电泳图。

图5为本发明分离的总状毛霉m-thf-02在豆豉产品中的应用评价。

具体实施方式

实施例1

筛选分离耐高温总状毛霉m-thf-02

本发明的目的是针对成都太和坊酿造有限公司生产的豆豉曲料进行的菌株分离，地址：四川成都市新都区新繁镇庆香路388号生产批号：20181210；分离出一株总状毛霉m-thf-02，且将分离的总状毛霉并制成三级菌种在发酵豆豉中进行应用，从而缩短发酵周期，提高其营养成分及其生产效率，确保了产品的可控性，从而降低产品的风险。

1.菌株的筛选

从150份的样品逐一加入生理盐水进行稀释，选取稀释梯度为10^-2、10^-3样品稀释液涂布pda平板28℃培养48-72h，挑取挑选生长旺盛菌落，用平板划线法接种到pda培养基上；并将培养基放入培养箱继续培养，待菌落长出较多时，继续划线纯化，直到纯化出单一菌落，在pda培养基划线纯化3-5代，获得纯化20菌株。

（1）干酪素琼脂培养基进行初筛：采用透明圈法，将20株纯化菌株接种到黄豆培养基中，在28℃发酵48h，加入0.85%的无菌生理盐水进行浸泡毛霉豆曲得到粗酶液，将灭菌的干酪素琼脂培养基，倒入9cm的无菌培养皿中，大概在15-20ml，取直径灭菌10mm的滤纸片浸入酶液浸泡1h，晾干，贴到冷凝的干酪素琼脂平板上，每次做三个平行。置于40℃下保温8h，用游标卡尺测定其透明圈的直径，选取透明圈直径较大的菌株进行复筛。初筛菌株发酵上清液中透明圈直径如表1所示：

表1初筛菌株发酵上清液中透明圈直径

。

注：根据表1的结果可知，选择透明圈直径最大的一株霉菌，即m-thf-02（直径为16.62±1.56mm）作为目标总状毛霉。

（2）复筛：将初筛选获得菌株接种于黄豆培养基中，28℃静置培养48-72h，加入0.85%的无菌生理盐水进行在40℃的水浴中浸泡毛霉豆曲1h得到粗酶液，在冷冻离心机4℃下、10000r/min离心10min，取上清液，用福林法测定其中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶，得到一株酶活较高的菌株，命名为：thf-02，将其标定为目标总状毛霉。

采用福林法测定其中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活力。具体方法如下：

在试管组（空白）和试管组（酶试样，三个平行）中各加入不同接种条件下的粗酶液1ml，在40℃的水浴中预热2min，空白加入0.4mol/的三氯乙酸2ml，试样中加干酪素溶液1ml摇匀，40℃反应10min后，在试管组（空白）加干酪素溶液1ml，试管组（酶试样）加2ml三氯乙酸，静止10min后过滤，分别吸取滤液1ml，各加0.4mol/的碳酸氢钠5ml，福林试剂1ml，置于40℃保温发色20min，在紫外分光光度计680nm测定吸光度。测得的目标总状毛霉m-thf-02酶活力大小如表2所示：

表2目标总状毛霉m-thf-02与其他菌株的酶活力大小比较（u/100g）

。

注：根据表2结果可知，目标总状毛霉m-thf-02的酸性蛋白酶、中性蛋白酶的酶活力显著高于其他4株菌株（p＜0.05）。

2.菌株的耐高温驯化及遗传稳定性分析

利用传统形态学鉴定的方法，对经过复筛分离、纯化得到的总状毛霉m-thf-02进行观察，具体结果如图2所示。根据其形态观察，生产用的总状毛霉的菌落直径为32mm，菌丝高度为7-9mm，颜色为白色，而目标菌株的菌落直径50mm，菌丝高度在12-14mm，初期颜色为白色、中后期变为褐灰色，菌丝生长有褐色孢子。通过显微镜观察到菌株thf-02在显微镜下顶端孢子囊为椭球型，孢囊梗与囊轴连接，接连处无囊托、无假根；根据菌株的菌落和孢子形态等特征，初步推断该菌属为毛霉菌。

3.菌株生长速率的测定

在无菌环境下，把复筛总状毛霉m-thf-02与现有的豆豉生产用总状毛霉采用点值法接种至pda的培养基中测定其生长速率，从图3中可以看出，生产用总状毛霉与总状毛霉m-thf-02在12h开始缓慢的生长，随着时间的延长，菌落直径不断的增大，在72h后生产用的总状毛霉与总状毛霉m-thf-02的菌落直径分别为47.13±3.25、54.04±1.04。

4.菌株分子生物学鉴定

4.1dna的提取：

（1）将已重悬在纯净水或者缓冲液（pbs）中约50-100mg（湿重）的真菌或细菌细胞添加到裂解管中，然后添加750ul的裂解液到裂解管中，在涡旋仪上最大速下振荡5min以上混匀。

（2）将裂解管在10,000xg的离心力下离心1min。

（3）将上一步所得上清400μl加到3号柱f中，3号柱f套在一个收集管里，在8,000xg的离心力下离心1min。丢弃过滤柱。

（4）添加1200μl的基因组dna裂解液到上一步的收集管中充分混匀。

（5）将2号柱套在一个新的收集管里。

（6）从步骤4中吸取800μl混合液加到2号柱中，在10,000xg下离心1min，倒掉收集管中废液。

（7）重复步骤（6）。

（8）2号柱套在一个新的收集管内，添加200μl的基因组dna洗涤液1到2号柱中，在≥10,000xg下离心1min。无需倒掉收集管中的废液，即可直接进行下一步。

（9）添加500μl的基因组dna洗涤液2到2号柱中，在≥10,000xg下离心1min。

（10）将2号柱移至干净的1.5ml离心管中直接添加100μl的基因组dna洗脱液到柱基质上（洗脱液事先在65-70℃水浴中预热效果更好），室温下放置2-5min，在≥1，000xg下离心1min来洗脱基因组dna。

18srdna序列分析：采用提取dnapcr方式进行18srdna扩增。使用细菌18srdna的通用引物进行pcr扩增，引物序列如下：

p1：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcggagtt3’)；

p2：its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)；

pcr反应体系（25μl）见表3。扩增反应条件为：预变性：95℃、5min，变性：94℃、45s，复性：55℃、45s，延伸：72℃、45s，30个循环，补充循环：72℃、1min。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后的pcr产物送交成都罗宁生物股份有限公司进行测序。其中，以菌株m-thf-02基因组为模板，利用真菌通用引物pcr扩增其18srdna序列，pcr产物经琼脂糖电泳验证，电泳结果发现仅有一条单一条带目的，条带大小在629bp左右，与预期长度一致，扩增产物电泳图如图4所示。

表318srdna反应体系

。

实施例2

目标总状毛霉m-thf-02的工业化生产豆豉的应用

1.应用方法

（1）分别将生产用总状毛霉与thf-02在无菌的条件下接入pda斜面培养基在28℃培养48-72h，待斜面培养基上长满毛霉孢子（灰白色或白色）后置于冰箱（0-4℃）备用，在无菌的条件下，用接种环钩取毛霉试管原种1~2环，接种于500ml的三角瓶的培养基中，塞好棉塞，充分振荡使菌种与培养基接触混匀制成二级菌种。将豆渣与米粉1:1混合拌匀后分装于干燥的敞口瓶中，约80-100g，用干净棉塞和牛皮纸封闭瓶口，置于蒸料池中，常压整料60min后取出，将上述原料取出后充分振荡摇匀并冷却2-3h，取二级种三角瓶充分震荡用无菌水2:3的比例稀释，其孢子的含量约为10⁵~10⁶cfu/ml用灭菌的注射器吸取稀释液，每瓶接种量为8-10ml，最后震荡摇匀，置于28℃静置培养48-52h，待培养基长满毛霉孢子（白色或者灰白色），从敞口瓶中抠出置于灭菌的簸箕中，按1：3（豆豉毛霉1；3）加入烘干米粉，然后充分混合均匀，无块状，然后置于保存室中晾摊保存（室温保存控制在18℃，定期要翻动）。

（2）选择成熟、饱满、均匀、新鲜的颗粒，要求蛋白质含量高，无虫蚀，无霉烂变质及杂质少，去除杂色豆及半边豆。

（3）将原料清洗后在30℃-35℃的温水中浸泡1.5h，浸泡水位淹过原料30cm为宜，然后在121℃高压蒸煮20-25min。

（4）前发酵：待原料冷却至室温（30-37℃）后将按三级菌种0.5%-1.0%与原料拌匀，在28-30℃进行制曲，温度不超过32℃，制曲时间为48-72h，相对湿度控制在90-95%。

（5）后发酵：将制曲后豆豉添加8%-10%的食盐，2.5%-5%的白酒，在常温下进行自然发酵，每隔30d测定其里氨基态氮、总酸、含盐量的测定。

2.目标总状毛霉m-thf-02用于豆豉生长的状况比较

将目标总状毛霉m-thf-02培养不同时间后，测量菌丝的生长高度，同时观察豆豉在三角瓶表面的生长状况，详见表4：

表4目标总状毛霉m-thf-02在豆豉表明生长状况

。

3.比较目标总状毛霉m-thf-02与生产用总状毛霉应用过程中的酶活力

将上述两种毛霉用于发酵豆豉生产，分别测定两种毛霉在不同料层厚度时的酶活力，具体结果如表5所示：

表5目标总状毛霉m-thf-02与生产用总状毛霉在不同料层厚度发酵后的酶活力情况

。

注：生产用总状毛霉发酵厚度达到20cm时，其中性蛋白酶活力、碱性蛋白酶活力以及酸性蛋白酶活力均不敌本发明所分离的目标总状毛霉m-thf-02。而当发酵厚度达到30cm时，目标总状毛霉m-thf-02的中性蛋白酶活力、碱性蛋白酶活力与酸性蛋白酶活力更是显著高于生产用总状毛霉。

4.应用至毛霉豆豉生产时该菌株的稳定性试验

为了验证目标总状毛霉thf-02在毛霉豆豉工业化生产中的稳定，需要连续进行8次以上的发酵试验。其中两种应用至毛霉发酵豆豉发酵20天后豆豉的氨基态氮含量、总酸含量、含盐量的变化具体结果详见表6；两种毛霉在30℃条件下培养后的酶活力结果比较详见表7。

表6生产用总状毛霉与目标总状毛霉thf-02发酵豆豉发酵20天后豆豉的氨基态氮含量、总酸含量、含盐量的变化

。

注：根据表6的结果可知，本发明分离的目标总状毛霉m-thf-02在发酵豆豉生产过程中，发酵周期达到20天时，在控制豆豉食盐含量与传统生产用总状毛霉制得的豆豉食盐含量持平甚至略低水平的情况下，其氨基酸态氮的含量显著高于生产用总状毛霉，总酸略高于生产用总状毛霉。由此可见，本发明分离的目标总状毛霉m-thf-02应用于发酵豆豉的生产过程中能有效提高豆豉的品质。

表7生产用总状毛霉与目标总状毛霉m-thf-02在30℃培养时的形状及酶活

。

注：将目标总状毛霉m-thf-02与生产用总状毛霉置于30℃条件下培养后，结果发现，目标总状毛霉m-thf-02无论是在菌落直径、透明圈直径、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶以及菌丝高度上均显著优于生产用总状毛霉。由此可见，本发明分离得到的目标总状毛霉m-thf-02相比传统生产用总状毛霉的耐热性更佳，且在30℃高温条件下，该目标总状毛霉m-thf-02具有耐高温、且产蛋白酶高的能力，克服了传统毛霉不耐高温的问题，且应用于豆豉的生产中能显著提高豆豉成曲的酶活力，能有效缩短发酵周期，生长迅速，菌丝长，能大幅缩短豆豉的制曲时间，提高生产效率，对豆豉产品包裹性强，能有效改善豆豉组织形态，确保了产品质量的稳定与安全，减少企业的资金压力；另一方面该菌种能够四季进行生产，可以有效的提高企业的经济效益。

5.感官评价

品评人员由从事调味品风味研究工作并经过半年品评训练的人员组成。每个样品由10名品评人员分三次进行品评。在20℃的品评环境下，对目标总状毛霉m-thf-02发酵的样品以及传统生产用总状毛霉发酵的样品进行香气、色泽、滋味、形态的评价，取其平均值作为最终评价结果；评分标准如表8所示，评分结果如图5所示。

表8豆豉的感官评分表

。

注：结合表8与图5的结果可知，采用目标总状毛霉m-thf-02制得的豆豉尤其在色泽、滋味、形态评分上均高于传统的生产用总状毛霉制得的豆豉。尤其在总分上，生产用的总状毛霉感官评价总得分为67分；目标总状毛霉m-thf-02的感官评价得分为82分，目标总状毛霉m-thf-02得分高主要表现在豆粒组织形态比生产用的总状毛霉稍强，呈黑褐色有光泽，具有豆豉特有的滋味和香味、余味有咸香味、无苦味、涩味。而生产用的总状毛霉生产的豆豉组织形态较软结团，色泽呈褐黄色，具有豆豉所特有的滋味与香味，但余味有点咸味和苦味；因此目标总状毛霉m-thf-02生产得到的豆豉明显高于传统总状毛霉生产的豆豉。由此可见，本发明分离的总状毛霉m-thf-02仍能在圆盘制曲发酵厚度为30cm时赋予豆豉浓郁的酱香、豉香、鲜香，优良的色泽、其产品口感醇厚，滋味鲜美。

综上所述，本发明得到的总状毛霉m-thf-02，最适的生长温度在28-30℃，具有耐高温、且产蛋白酶高的能力，克服了传统毛霉不耐高温的问题，且应用于豆豉的生产中能显著提高豆豉成曲的酶活力，能有效缩短发酵周期，生长迅速，菌丝长，能大幅缩短豆豉的制曲时间，提高生产效率，对豆豉产品包裹性强，能有效改善豆豉组织形态，确保了产品质量的稳定与安全，减少企业的资金压力；另一方面该菌种能够四季进行生产，可以有效的提高企业的经济效益。此外，本发明得到总状毛霉m-thf-02，与现有工业化生产的毛霉豆豉曲料厚度在15-20cm的总状毛霉相比，总状毛霉m-thf-02仍能在圆盘制曲发酵厚度为30cm时赋予豆豉浓郁的酱香、豉香、鲜香，优良的色泽、其产品口感醇厚，滋味鲜美。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110>成都太和坊酿造有限公司

<120>一株耐高温的总状毛霉及其应用

<160>1

<170>dnastarlasergene11.0

<210>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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