一株降解磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的曲霉及其筛选方法与应用与流程

[0001]
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种采用曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的筛选方法及其应用。


背景技术：

[0002]
近年来，随着传统的溴代阻燃剂因生烟量大、腐蚀性强和易释放有毒气体等缺点逐渐退出阻燃剂市场，新型的有机磷阻燃剂作为溴代阻燃剂的理想替代品被广泛应用于纺织品、电子产品、塑料、家具以及涂料等多种商业产品的生产中。磷酸三苯酯(tphp)和磷酸三甲苯酯(tcp)是两种常用的有机磷阻燃剂，作为添加型化学助剂，这两种阻燃剂通常以掺杂、吸附等物理混合方式加入到各类产品中，并未与产品通过化学键合的方式进行有机结合，因而很容易通过挥发、磨损、腐蚀和渗漏等途径从产品中脱离释放而进入自然环境，并随大气和水体的迁移造成环境污染。目前，在空气尘埃、水体、土壤、河流底泥和沉积物等多种环境介质以及生物体都能检测到tphp和tcp的存在。残留在生物体内的tphp和tcp会对机体产生内分泌干扰性、生殖毒性、神经毒性和免疫毒性等多方面的毒害效应。作为一类新型的有机污染物，这两种有机磷阻燃剂在环境中的生态风险和健康安全效应引起了环境研究者的广泛关注。
[0003]
目前，opfrs的降解去除主要采用物理化学法和微生物降解法。物理化学法因为其运行成本高易造成二次污染等问题，不能成为污染治理的最佳选择。微生物法降解法因其对环境友好和低成本的特性从而成为最安全、经济、有效的水体有机污染修复途径之一，但是微生物法降解在实际应用过程中往往效率不高，因此opfrs高效降解菌的筛选及应用具有一定的研究意义。从目前的专利申请情况来看，有申请号cn201610287265.3，名称为一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用，申请号cn201910472687.1，名称为一种能够降解磷酸三苯酯的鞘氨醇单胞菌及其驯化方法与应用，这些专利报道中 tphp降解的初始浓度只有1mg/l，而本发明提供的曲霉(aspergillus sp.fjh-1) 可以有效降解浓度高达20mg/l以上的tphp，同时，曲霉(aspergillus sp.fjh-1) 不但可以降解tphp也可以有效降解tcp，可为强化和调控这两种有机磷阻燃剂的微生物修复提供参考。


技术实现要素：

[0004]
本发明的首要目的在于提供一种采用曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的筛选方法及其应用，通过曲霉(aspergillus sp. fjh-1)对磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的快速高效降解，为其污染治理和生物修复提供技术方法。
[0005]
本发明的目的通过以下技术方案实现。
[0006]
一种采用曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的方法，包括以下步骤：(1)用无菌生理盐水冲洗pda平板上的曲霉(aspergillus sp.fjh-1)，制成曲霉
(aspergillus sp.fjh-1)孢子液；(2)将曲霉(aspergillus sp.fjh-1)孢子液接种到已灭菌的pda培养基中，摇床中振荡培养；(3)收集步骤(2)培养的菌球，然后接种于磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯降解培养基中摇床振荡培养；(4)降解培养基中的磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯经过气相色谱质谱联用仪测定，分析曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯的降解效果。
[0007]
优选的，步骤(1)所述的曲霉(aspergillus sp.fjh-1)孢子液的制备包括：用无菌生理盐水冲洗曲霉(aspergillus sp.fjh-1)平板，用无菌接种环将平板表面的孢子刮下，经双层无菌纱布过滤后得到的曲霉(aspergillus sp.fjh-1) 孢子液。
[0008]
优选的，步骤(1)所述的曲霉(aspergillus sp.fjh-1)孢子液的浓度控制：利用分光光度计测定孢子液在600nm处的吸光值，用无菌生理盐水将孢子液稀释调节至吸光值为od
600
＝0.45。
[0009]
优选的，步骤(1)和(2)所述的pda培养基组成为：200g/l马铃薯； 20g/l葡萄糖；3g/l磷酸二氢钾；1.5g/l硫酸镁；0.008g/l盐酸硫胺素，超纯水1000ml，ph为6.0。
[0010]
优选的，步骤(2)所述的培养条件为：温度为30℃，转速为160rpm，培养时间为72h。
[0011]
优选的，步骤(3)所述收集培养的菌种包括：将富集的菌液过滤，收集菌球，用无菌生理盐水洗涤3次。
[0012]
优选的，步骤(3)所述的接种量为50g/l湿重菌球。
[0013]
优选的，步骤(3)所述的磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯降解培养基组成为：1g/l(nh
4
)
2
no
3
，1.5g/l kh
2
po
4
，3g/l k
2
hpo
4
，2ml/l微量元素溶液，1000ml 超纯水，ph为6.5-7.5。其中微量元素溶液组成为：4g/l mgso
4
，1g/l cuso
4
， 1g/l mnso
4
，1g/l feso
4
·
7h
2
o，1g/l cacl
2
，1000ml超纯水。
[0014]
优选的，步骤(3)所述的培养条件为：温度为30℃，转速为160rpm，培养时间为6d。
[0015]
所述的曲霉(aspergillussp.fjh-1)筛选于广东贵屿电子垃圾厂垃圾堆放地，此菌株的驯化采用梯度增加污染物的方法，在无机盐培养基中加入磷酸三苯酯，配置磷酸三苯酯浓度梯度为50、75、100、125、150mg/l的驯化培养基，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化。所述曲霉(aspergillussp.fjh-1)可以从广东省微生物菌种保藏中心获取，保藏号为gdmccno.61136，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0016]
在此条件下降解培养,其能够在3天内将无机盐培养基中初始浓度为 5mg/l的磷酸三苯酯降解97.17％，6天内将无机盐培养基中初始浓度为20mg/l 的磷酸三甲苯酯降解80.26％。
[0017]
与现有技术相比，于本发明具有如下优点与技术效果：1、本发明提供了一种采用微生物降解有磷酸三苯酯和磷酸三苯酯的方法，该方法对环境适应性强，对磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯降解效果较好，且成本较低。
[0018]
2、采用本发明的方法3天内对初始浓度为5mg/l的磷酸三苯酯的降解率达到97.17％,6天内对初始浓度为20mg/l的磷酸三甲苯酯的降解率达到 80.26％。
附图说明
[0019]
图1是磷酸三苯酯标准样品的gc-ms图；图2为曲霉(aspergillus sp.fjh-1)的its rdna系统发育树分析；图3为不同时间曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解5mg/l磷酸三苯酯的降解曲线图；图4为不同时间曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解20mg/l磷酸三苯酯的降解曲线图；图5为不同时间曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解20mg/l磷酸三甲苯酯的降解曲线图；图6为投菌量对曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯的影响；图7为ph对曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯的影响；图8为tphp初始浓度对曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯的影响；图9为葡萄糖初始浓度对曲霉(aspergillus sp.fjh-1)降解磷酸三苯酯的影响。
具体实施方式
[0020]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0021]
实施例11、降解菌株的筛选(1)采集污染场地土壤(广东贵屿镇电子垃圾堆放地中的污染土壤)，称取1g污染土壤样品加入到富集培养基中，于30℃、160rpm恒温摇床中培养。富集培养基的主要成分为：5g/l牛肉膏，10g/l蛋白胨，5g/l nacl，超纯水1000 ml，ph为7.0。
[0022]
(2)每14天转接1次，每次转接的同时提高25mg/l的磷酸三苯酯的浓度，直到磷酸三苯酯的浓度达到150mg/l后，接种到涂有100ul浓度为1mg/l 的磷酸三苯酯为唯一碳源的无机盐培养基中。无机盐培养基的主要成分为：1g/l (nh
4
)
2
no
3
，1.5g/l kh
2
po
4
，3g/l k
2
hpo
4
，2ml/l微量元素溶液，1000ml超纯水，ph为7.0。其中微量元素组成为：4g/l mgso
4
，1g/l cuso
4
，1g/l mnso
4
，1g/l feso
4
·
7h
2
o，1g/l cacl
2
。
[0023]
(3)连续培养10周后，采用稀释梯度法、平板涂布法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快、形态不同的菌落，确保是纯的单一菌株后，将其接种到固体斜面培养基上，于4℃保存于冰箱中，待后续进行降解实验。固体斜面培养基的主要成分为：3g/l牛肉膏，10g/l蛋白胨，5g/l nacl，琼脂18g/l，超纯水1000 ml，ph为6.5。
[0024]
2、降解菌株的鉴定(1)菌体及菌落形态特征该菌株为不规则圆形，表面粗糙，扁平隆起，无光泽，半湿润，边缘为绿色环形，孢子梗细长，直径均匀，分枝明显，叉状锐角分枝，分枝不对称。
[0025]
(2)its rdna序列通过its rdna序列测定和分析比较，构建系统发育树，见图2。分析可知，该序列与aspergillus.sp的its rdna序列的同源达到100％，该菌株确定为曲霉(aspergillus sp.)，序列如序列表1所示，命名为aspergillus sp.fjh-1，其itsrdna序列(共539bp)已提
交到gene bank，登录号为mt107779。该真菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no.61136，该菌于2020年8 月12日保藏。
[0026]
实施例2曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸三苯酯的降解分析将曲霉(aspergillus sp.fjh-1)孢子液接种到pda固体培养基平板上，置于恒温培养箱内，30℃培养5d，pda培养基的主要成分为：200g/l马铃薯；20g/l 葡萄糖；3g/l磷酸二氢钾；1.5g/l硫酸镁；0.008g/l盐酸硫胺素，超纯水 1000ml，ph为6.0。
[0027]
用无菌生理盐水冲洗曲霉(aspergillus sp.fjh-1)平板，用无菌接种环将平板表面的孢子刮下，经双层无菌纱布过滤后得到的孢子液，利用分光光度计测定孢子液在600nm处的吸光值，用无菌生理盐水将孢子液稀释调节至吸光值为od
600
＝0.45，将200μl孢子液加入到150ml已灭菌的pda液体培养基中富集培养，在30℃、160rpm条件下培养3d成菌球，将富集培养的菌液经双层纱布过滤，用无菌生理盐水反复冲洗3次，收集冲洗后的菌球，将菌球投加量控制在50g/l加入到含磷酸三苯酯5mg/l的降解培养基中进行降解实验，降解体系为20ml，在30℃、160rpm的培养条件中培养6d后，样品经过gc-ms 测定，分析菌体对磷酸三苯酯的降解效果。实验设置三组平行，两组空白对照。降解培养基的主要成分为：1g/l(nh
4
)
2
no
3
，1.5g/l kh
2
po
4
，3g/l k
2
hpo
4
，2ml/l 微量元素溶液，1000ml超纯水，ph为7.0。其中微量元素组成为：4g/l mgso
4
， 1g/l cuso
4
，1g/l mnso
4
，1g/l feso
4
·
7h 2
o，1g/l cacl
2
。
[0028]
磷酸三苯酯的浓度采用gc-ms进行测定，分析条件如下：(1)气相色谱条件色谱柱：sh-rxi-5silms；进样口温度：280℃；升温程度：初温50℃，保持1min，以15℃/min升至200℃，保持1min；再以4℃/min升至250℃，保持2min；载气：高纯氦，纯度大于99.999％；恒流控制：1ml/min；模式：不分流进样；进样量：1ul。
[0029]
(2)质谱条件离子源：ei源；温度：200℃；接口温度：280℃；溶剂延迟时间：3min；扫描质量范围：50-450m/z；特征离子：326m/z。
[0030]
配置磷酸三苯酯浓度分别为0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0mg/l的标准溶液，绘制磷酸三苯酯浓度-峰面积标准曲线，磷酸三苯酯标准样品的gc-ms 图如图1所示。以不加菌为空白对照组(对照组除了不接种菌种以外，其余操作及参数均与实验组相同)，培养6d后，测得空白对照组的降解培养基中的磷酸三苯酯浓度为4.89mg/l，而上述测试得到实验组的降解培养基中的磷酸三苯酯浓度为0.138mg/l，通过对照组和实验组(实施例2提供的方法)的比较可以得到，实验组降解效率为97.17％，结果如图3所示。
[0031]
实施例3
[0032]
实施例3同实施例2，只是降解实验中，降解培养基中磷酸三苯酯的投加量为20mg/l，降解培养基ph为7.0，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为 160rpm，培养时间为6d。最终曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸三苯酯的降解率分别为92.47％。如图4所示。
[0033]
实施例4
[0034]
实施例4同实施例2,只是降解实验中，降解培养基中磷酸三甲苯酯的投加量为20mg/l，降解培养基ph为7.0，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为6d。
[0035]
磷酸三甲苯酯的浓度采用gc-ms进行测定，分析条件如下：(1)气相色谱条件色谱柱：sh-rxi-5silms；进样口温度：280℃；升温程度：初温100℃，保持1min，以15℃/min升至250℃，保持1min；以2℃/min升至210℃，保持1min；以25℃/min升至250℃，保持1min；以2℃/min 升至280℃，保持1min载气：高纯氦，纯度大于99.999％；恒流控制：1ml/min；模式：不分流进样；进样量：1ul。
[0036]
(2)质谱条件离子源：ei源；温度：230℃；传输线温度：280℃；反应监测模式：srm；特征离子：368m/z。
[0037]
最终培养6d后，曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸三甲苯酯的降解率为80.26％。如图5所示。
[0038]
实施例5
[0039]
实施例5同实施例2,只是降解实验中，曲霉(aspergillus sp.fjh-1)投菌量分别为10g/l、30g/l、50g/l、70g/l，降解培养基ph为7.0，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为6d，最终曲霉(aspergillus sp. fjh-1)对磷酸三苯酯的降解率分别为91.37％、94.1％、97.26％、95.31％。如图 6所示。
[0040]
实施例6
[0041]
实施例6同实施例2,只是降解实验中，降解培养基ph分别为4、5、6、 7、8、9，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为6d，最终曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸三苯酯的降解率分别为92.69％、94.33％、 95.44％、97.03％、96.13％、94.27％。如图7所示。
[0042]
实施例7
[0043]
实施例7同实施例2,只是降解实验中，降解培养基中磷酸三苯酯初始浓度分别为2mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l，降解培养基ph为7.0，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为6d，最终曲霉(aspergillus sp.fjh-1)对磷酸
三苯酯的降解率分别为 93.87％、97.31％、95.89％、93.74％、91.09％、74.09％、56.23％。如图8所示。
[0044]
实施例8
[0045]
实施例8同实施例2，只是降解过程中，葡糖糖初始浓度的投加量分别为0g/l、1g/l、3g/l、5g/l、7g/l、10g/l，降解培养基ph为7.0，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为6d，最终曲霉(aspergillus sp. fjh-1)对磷酸三苯酯的降解率分别为97.46％、97.14％、96.60％、96.74％、95.99％、 84.70％。如图9所示。
[0046]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表1tgcggaaggatcattactgagtgcgggctgcctccgggcgcccaacc tcccacccgtgaatacctaacactgttgcttcggcggggaaccccctcggg ggcgagccgccggggactactgaacttcatgcctgagagtgatgcagtct gagtctgaatataaaatcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttc cggcatcgatgaagaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcag aattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattc cggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccggcttgt gtgttgggtcgtcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcg gcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgactag ggccggccgggcgccagccgacgtctccaaccatttttcttcaggttgac ctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcata。

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