一株血杆菌及其在防治黄瓜枯萎病中的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一株生防菌及其应用，特别是涉及一株血杆菌及其在防治黄瓜枯萎病中的应用。


背景技术：

[0002]
黄瓜枯萎病是一种重要的真菌性土传病害，由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。尖孢镰刀菌黄瓜专化型在黄瓜的各个生长阶段均能够感染黄瓜植株。一般来说，黄瓜枯萎病的田间发病率处于10％-30％左右，在重茬地，发病率高达50％以上，危害严重时造成绝产。尖孢镰刀菌黄瓜专化型在全球范围内分布广泛，在中国、美国、日本、韩国、法国等多个国家均造成过重大农业生产损失。
[0003]
目前使用生防菌防治黄瓜枯萎病的研究中，已有报道用来防治黄瓜枯萎病的生防菌资源包括：哈茨木霉(trichoderma harzianum)sh2303 cgmcc no.4963(cn103283786a)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)b201 cgmcc no.5786(cn103374536b)、em菌肥(cn106278680a)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)3512a cctcc no.m 207051(cn101575581a)、棘孢木霉(trichoderma asperellum)gy20 cgmcc no 4899(cn103013839b)、白刺链霉菌(streptomyces albospinus)ct205 cgmcc no 7434(cn103275892a)、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)fj174 cgmcc no.14642(cn107937313b)、复合菌群(沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、链霉菌与酿酒酵母菌，cn102010825a)、青霉菌(penicillium sp.)nsy15 cgmcc no.13188(cn106591154b)、长柄木霉(cn104738098a)、贝莱斯芽胞杆菌(bacillus velezensis)nh 1cctcc no：m 2017336(cn107586737a)、绿肉座菌和淡紫拟青霉菌(cn105779302a)、黄赭色链霉菌sq11和多粘类芽孢杆菌jzb120001(cn110669701a)、短密木霉bf06(cn105462858a)、白色链霉菌(streptomyces albus)2013cctccno:m2013269和暗黑链霉菌(streptomyces tenebrarius)m929cctccno:m2013710(cn104342389a)、长柄木霉(cn104719347a)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)sqr t037 cgmcc no.3308(cn101696390b)、长柄木霉(trichoderma longibrachiatum)和柠檬绿木霉(trichoderma citrinoviride)(cn101637187a)、多粘类芽孢杆菌nsy50 cgmcc no.12189(cn105734000a)、类芽孢杆菌(cn101018854b)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)2-17cgmcc no.7127(cn104017733b)、解淀粉芽孢杆菌hfj 7cgmcc no.10011(cn104894010b)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)cgmcc no.6491(cn102978128a)、菌根真菌(glomus intraradices cn102652487a)、黄麻链霉菌nf0919菌株cgmccno.3968(cn102870821a)、塔宾曲霉qf05 cgmcc no.13563(cn106591157a)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ncpsj7 cctcc no：m2013098(cn103173397b)、解淀粉芽孢杆菌jcd h 12cgmcc no.11856(cn105420156b)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtlis)b579 cgmcc no.2270(cn101401587b)、贝莱斯芽抱杆菌(bacillus velezensis)e6 cgmcc no.9665(cn108004185a)、蜡状芽胞杆菌(cn106434493a)、解淀粉芽孢杆菌hfj 7cgmcc no.10011
(cn104877937b)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)gp72 cgmcc no.1748、天牛微杆菌(microbacterium saperdae)yjjk 2cgmcc no.17951(cn110331114a)、棘孢木霉(trichoderma asperellum)zjsx5003cgmcc no.6480(cn103484376b)、哈茨木霉菌株l(cn101057593a)、芽胞杆菌(bacillus sp.)，cgmcc no.12496(cn105838656a)、复合菌(枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌，cn103966149b)、粉红螺旋聚孢霉67-1(田甜等，中国生物防止学报，2014)、解淀粉芽孢杆菌cd5bc cctccno:m 2016232(cn105907683b)、钩状木霉(cn102499265a)、多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)gy40 cgmcc no.14481(cn108277172a)等。
[0004]
但是，以上公开的现有技术存在菌剂使用后菌种在作物使用部位难以定植或者定植后存活时间短，丰度较低，菌种只是在使用菌剂后的短时时间内具有较好的防病效果，持效期短。
[0005]
此外，目前并没有公开血杆菌应用于黄瓜枯萎病防治的技术。


技术实现要素：

[0006]
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一株血杆菌及其在防治黄瓜枯萎病中的应用。血杆菌sanguibacter sp.m0055对引起黄瓜枯萎病的尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporum)具有显著的拮抗作用。使用该菌株的菌悬液在黄瓜移栽幼苗时进行蘸根处理，能显著降低黄瓜枯萎病病害发生，对黄瓜枯萎病的防效显著优于多菌灵，并且菌种能够在黄瓜的根部长期定植，对黄瓜形成长效保护。本发明为黄瓜病害的无公害防治提供了重要的菌种资源，具有重要的实用价值。
[0007]
本发明的一株血杆菌及其在防治黄瓜枯萎病中的应用技术方案为，一株血杆菌，所述血杆菌为血杆菌sanguibacter sp.m0055，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏编号为cgmcc no.20597，保藏日期为2020年9月4日。
[0008]
本发明还保护所述血杆菌在防治黄瓜枯萎病中的应用。所述黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的，具体为黄瓜苗期枯萎病。
[0009]
一种用于防治黄瓜枯萎病的产品，活性成分包括权利要求1所述血杆菌sanguibacter sp.m0055的细胞悬浮液，有效活菌数为10
6-10
10
cfu/ml。
[0010]
所述血杆菌sanguibacter sp.m0055的细胞悬浮液制备方法为：
[0011]
(1)将血杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于大豆酪蛋白培养基中28-32℃、180-200rpm培养12-16h得大豆酪蛋白培养基培养物；
[0012]
(2)将大豆酪蛋白培养基培养物转接到内含大豆酪蛋白培养基中28-32℃、180-200rpm培养68-75h得培养液；
[0013]
(3)收集培养液5000-8000rpm离心10-15min，丢弃上清液；
[0014]
(4)使用含有体积浓度0.05-0.08％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液重悬血杆菌m0055细胞，得到血杆菌m0055浓度为10
8-10
10
cfu/ml的细胞悬浮液。
[0015]
优选的，所述血杆菌sanguibacter sp.m0055的细胞悬浮液制备方法为：
[0016]
(1)将血杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h得大豆酪蛋白培养基培养物；
[0017]
(2)将大豆酪蛋白培养基培养物转接到内含大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养72h得培养液；
[0018]
(3)收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液；
[0019]
(4)使用含有体积浓度为0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液重悬血杆菌m0055细胞，得到血杆菌m0055的细胞悬浮液母液。
[0020]
一种防治黄瓜枯萎病的方法，黄瓜幼苗使用如权利要求1所述血杆菌sanguibacter sp.m0055细胞悬浮液进行蘸根处理后栽培。
[0021]
具体为，使用含有体积浓度为0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液将血杆菌m0055的细胞悬浮液母液稀释至浓度为10
6
、10
7
、10
8
、10
9
、10
10
cfu/ml。将浓度为10
6
、10
7
、10
8
、10
9
、10
10
cfu/ml血杆菌细胞稀释悬浮液，将待移植栽培的黄瓜幼苗根部浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡10-30min，取出后沥干至不再有悬浮液滴下为止，进行栽培移植。
[0022]
本发明的有益效果为：
[0023]
本发明所使用的血杆菌菌株m0055分离葱地种蝇的肠道，葱地种蝇幼虫肠道内因葱地种蝇幼虫取食大蒜形成强烈的抗生环境，因此，血杆菌菌株m0055对不利环境具有极强的适应性，在施用至黄瓜根部后能够长期定植存活并且保持较高的丰度，对黄瓜根部形成长效保护，并且效果比化学农药多菌更高。
[0024]
本发明所提供的的血杆菌m0055能够有效防治黄瓜枯萎病。该菌株及其细胞悬浮液使用方法简单、易于操作，对黄瓜苗期枯萎病防治效果优于化学药剂多菌灵；并且，菌种使用后能够在黄瓜的根部长期定植且保持较高的菌群丰度，对黄瓜形成长效保护。本发明生防菌为黄瓜的无公害生产提供了重要的菌种资源，具有重大应用价值。
附图说明
[0025]
图1所示为本发明菌株m0055的16s rdna的pcr产物电泳图；
[0026]
图2所示为本发明菌株m0055的16s rdna的亲缘进化关系分析；
[0027]
图3所示为本发明菌株m0055对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporum)的拮抗活性照片(左侧为m0055拮抗尖孢镰刀菌黄瓜专化型，右侧为对照)；
[0028]
图4所示为菌株m0055对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporum)引起的黄瓜枯萎病盆栽防治效果(左侧为m0055拮抗尖孢镰刀菌黄瓜专化型盆栽处理组，右侧为只接种尖孢镰刀菌黄瓜专化型对照)；
[0029]
图5所示为血杆菌m0055在黄瓜根际的定植情况。
具体实施方式
[0030]
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0031]
实施例1
[0032]
分离和鉴定
[0033]
菌株分离样品为采集自山东省泰安市范镇蒜田的葱地种蝇幼虫，将采集的幼虫放入封口袋并记录。封口袋置于冰盒保存运送回实验室待用。幼虫带回实验室后，使用75％的乙醇消毒液进行体表消毒15s,随后使用无菌水清洗。消毒过程反复三次。消毒后的幼虫置
于解剖镜下，使用眼科手术剪将幼虫头部和尾部交掉，随后从虫体侧面将幼虫剖开，取出肠道。肠道置于1.5ml离心管内，加入100μl磷酸盐缓冲液后充分研磨。10倍梯度稀释至10-8，然后将稀释液涂布于大豆酪蛋白培养基平板，28℃培养箱培养24h后，挑取单菌落划线于新的大豆酪蛋白培养基平板，挑取划线后的单菌落保存在大豆酪蛋白培养基琼脂平板。
[0034]
将获得的纯菌株使用大豆酪蛋白培养基培养12h后，取25μl加入到pda平板边缘一侧距离平板外缘0.5cm处，随后在接种点对侧一处接种尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌饼，对照使用等体积液体大豆酪蛋白培养基代替菌液，每个细菌菌株设置3个平行对照，于26℃黑暗条件下培养5天后，观察尖孢镰刀菌黄瓜专化型的生长情况和抑菌圈情况。挑选对尖孢镰刀菌黄瓜专化型生长有明显抑制作用的细菌菌株进行鉴定。
[0035]
将所得菌株使用大豆酪蛋白培养基培养12h后，取1ml菌液2000g离心10min收集菌体，使用dna提取试剂盒提取菌株基因组dna。采用细菌16s rdna通用引物1492r(5
’-
ggctcgagcggccgcccgggttaccttgttacgactt-3
’
)和8f(5
’-
gcggatccgcggccgctgcagagtttgatcctggctcag-3
’
)以基因组dna为模板对细菌16s rdna序列进行扩增，扩增后pcr产物(见说明书附图图1)送上海生工生物有限公司测序，并将序列上传至genbank数据库，所得序列号为mt808787，使用genbank数据库进行鉴定时，菌株m0055序列与sanguibacter属相似性较高，但与模式菌株存在一定差异(见说明书附图图2)，最终鉴定为sanguibacter sp.。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2020年9月4日，保藏号：cgmcc no.20597。
[0036]
实施例2
[0037]
血杆菌m0055与尖孢镰刀菌黄瓜专化型的对峙培养试验
[0038]
使用60mm培养皿准备pda平板待用，在pda平板边缘一侧距离平板外缘0.5cm处打孔。将血杆菌m0055少量平板培养物接种于大豆酪蛋白培养基30℃、180rpm培养12h后，取25μl加入到pda平板边缘一侧孔内，随后在接种点对侧一处接种尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌饼，对照使用等体积液体大豆酪蛋白培养基代替菌液，每个细菌菌株设置3个平行对照，于26℃黑暗条件下培养5天后，观察尖孢镰刀菌黄瓜专化型的生长情况和抑菌圈情况。结果表明，血杆菌m0055对尖孢镰刀菌黄瓜专化型产生显著的抑制作用(见说明书附图图3)。
[0039]
实施例3盆栽实验
[0040]
少量血杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集6瓶培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬血杆菌m0055细胞，得到血杆菌m0055细胞悬浮液母液。随后，继续使用上述无菌磷酸盐缓冲液将血杆菌m0055的细胞悬浮液母液稀释至浓度为10
6
、10
7
、10
8
、10
9
、10
10
cfu/ml。
[0041]
使用上述不同浓度血杆菌细胞悬浮液稀释液，将一组10棵待移植栽培的黄瓜幼苗根部浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡30min，取出后沥干(不再有悬浮液滴下为止)准备栽培移植。另外一组10棵黄瓜幼苗使用无菌的清水进行如上的蘸根处理，沥干后准备移栽。使用栽培基质进行移栽上述幼苗，基质中每100g添加尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子悬浮液(10
2
cfu/ml)500ml充分浸湿，充分浸湿的基质装盆后移栽上述两组经过处理的黄瓜幼苗。黄瓜品种为黄瓜津绿10号。两组幼苗置于两个拖盆中培养，避免交叉污染。黄瓜幼苗置于光
照培养箱培养，温度30℃，光周期l:d＝16:8，相对湿度50％。10天后，观察黄瓜幼苗的发病情况。上述实验重复三次，计算发病率。结果如表1所示，接种血杆菌m0055显著降低了盆栽实验中黄瓜枯萎病的发病率，随着使用剂量的增加，黄瓜枯萎病发病率逐渐降低，10
9
和10
10
cfu/ml浓度下效果较好。
[0042]
表1盆栽实验结果
[0043][0044]
*统计方法为独立样本t检验。
[0045]
实施例4
[0046]
血杆菌m0055在黄瓜枯萎病防治中的应用
[0047]
于2020年8月-9月在山东省科学院东区试验基地选取重茬黄瓜温室大棚进行田间试验。黄瓜品种使用津绿10号。
[0048]
少量血杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有体积浓度0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬血杆菌m0055细胞，稀释得到血杆菌m0055浓度为10
9
cfu/ml的细胞悬浮液。
[0049]
试验分三组处理。第一组在黄瓜移栽时使用上述浓度为10
9
cfu/ml的细胞悬浮液进行蘸根处理后移栽。具体蘸根操作为：所有黄瓜苗从穴盘中取出后，黄瓜幼苗根部浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡30min，取出后沥干(不再有悬浮液滴下为止)准备栽培移植。第二组使用灭菌水代替m0055的细胞悬浮液进行蘸根处理，作为对照组。第三组使用多菌灵水溶液(多菌灵有效剂量为10mg/ml)代替第一组处理中的血杆菌m0055细胞悬浮液稀释液进行蘸根处理。每组分为5个小区进行试验。黄瓜幼苗移栽后10天，检查幼苗的发病情况。
[0050]
黄瓜幼苗枯萎病发病程度分为5级标准：0级，不发病，植株生长正常；1级，1/4以下根茎变黄，植株轻微矮化；2级，1/4-1/2根茎变黄，下部叶脉褪色；3级，1/2-3/4根茎变黄，茎基部纵裂；4级，3/4以上根茎变黄，或者植株枯萎死亡。
[0051]
病情指数＝∑(各级病株数
×
该病级值)/(调查总株数
×
最高级值)
×
100
[0052]
防效(％)＝(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数
×
100
[0053]
结果如表2所示，结果表明，血杆菌m0055处理组的病情指数为2.84％，防效高达71.93％；而多菌灵处理组的病情指数为4.92％，防效为51.4％。两组的病情指数与清水对照组相比显著下降，并且，血杆菌m0055对尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病防效优于多菌灵。
[0054]
表2田间试验结果
[0055][0056][0057]
*此列中数值后不同字母代表差异显著(one-way anova,p<0.05)
[0058]
实施例5
[0059]
血杆菌m0055在黄瓜根部的定植情况
[0060]
于2020年8月-9月在山东省科学院东区试验基地选取重茬黄瓜温室大棚进行田间试验。黄瓜品种使用津绿10号。
[0061]
少量血杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬血杆菌m0055细胞，稀释得到血杆菌m0055浓度为10
9
cfu/ml的细胞悬浮液。
[0062]
在黄瓜移栽时使用上述浓度为10
9
cfu/ml的细胞悬浮液进行蘸根处理后移栽。具体蘸根操作为：所有黄瓜苗从穴盘中取出后，黄瓜幼苗根部浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡30min，取出后沥干(不再有悬浮液滴下为止)准备栽培移植。于移栽后的0(未处理)、10、20、30、40、50天分别采集黄瓜根部样品，使用1g根部样品充分清洗表面后，清洗液提取dna备用。使用浓度为10
9
cfu/ml的血杆菌m0055 lb培养液1ml提取dna，还然后使用无菌水进行10倍梯度稀释(10-1-10-9
)，使用血杆菌m0055的特异性引物进行荧光定量pcr扩增实验，建立荧光值与细胞数的标准曲线。随后，通过标准曲线确定m0055在黄瓜根际的定植情况。结果表明，在使用血杆菌m0055悬浮液处理后的第10天，血杆菌m0055在根际的定植数量达到每克根1.2
×
10
7
cfu，在使用血杆菌m0055悬浮液处理后的50天内，血杆菌m0055在根际的定植数量稳定在每克根10
5
cfu数量级，能够在黄瓜根部长期定植。

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