一种促进节菱孢菌高效产孢的培养基及其方法与流程

[0001]
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种促进节菱孢菌高效产孢的培养基及其方法。


背景技术：

[0002]
节菱孢菌是在自然界中不常见的一类霉菌，会在适宜的条件下生长繁殖产生3-硝基丙酸(3-nitropropionicacid，3-npa)，3-硝基丙酸是一种亲神经毒性物质，可以损害人的中枢神经系统、消化系统、呼吸系统以及泌尿系统，人只要吃进少则100克，多则1000克霉变甘蔗即可导致丙酸中毒。现有研究表明，节菱孢菌在甘蔗产区(广东、广西)和变质甘蔗中毒发病区(主要是北方地区)的甘蔗样品中均有分布，分别为7.6%(9/19)和56.4%(53/94)，后者明显高于前者，甘蔗产区节菱孢菌产毒株占72.9%(35/48)，中毒发病区的产毒株占l7.6%(40/227)。
[0003]
3-硝基丙酸是一种生物素，大剂量多次注射3-npa(30mg/kg，注射2次)可通过选择性抑制琥珀酸脱氢酶从而抑制线粒体功能，妨碍细胞电活动的传导导致细胞死亡。3-硝基丙酸虽然有毒，但是万物相生相克，近年国内外研究发现适当剂量单次3-npa(20mg/kg，注射一次)预处理时可提高神经元的缺血和缺氧耐受性，其保护机制可能涉及腺苷受体的激活等环节。现有研究表明，红藻氨酸所致颞叶癫痫模型中，小剂量3-硝基丙酸预处理可以对红藻氨酸致痫大鼠海马神经细胞凋亡和p53蛋白表达有抑制作用，小剂量3-硝基丙酸预处理对红藻氨酸致痫大鼠海马细胞凋亡具有一定保护作用，其保护机制可能涉及腺苷受体的激活环节（陈利锋.3-硝基丙酸对红藻氨酸致痫大鼠海马神经细胞凋亡和p53蛋白表达影响研究[d]，2006 年，第一军医大学：神经外科学）。3-硝基丙酸预处理可通过开放线粒体atp敏感性钾通道，上调缺血半暗带区bcl-2蛋白表达，下调bax蛋白表达，减少神经元凋亡，对脑缺血损伤起保护作用（郑俩燕,许荣华,陈志斌,李红戈,梅元武.3-硝基丙酸预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注细胞凋亡的影响[j]，《广东医学》2008年12期）。3-硝基丙酸多次预处理可通过减少丙二醛生成，激发还原型谷胱甘肽合成，保护多巴胺神经元，达到预防帕金森病的作用（梁直厚,邓学军,孙圣刚,等.3-硝基丙酸多次预处理对多巴胺能神经元的保护机制[j]，《中国临床康复》2006年34期）。3-npa预处理能诱导脑缺血耐受,其机制可能是上调glut1和glut3 mrna及蛋白表达水平，维持脑组织的能量供给（陈为安,杨得奖,屈洋,张旭.3-硝基丙酸预处理对脑缺血耐受模型glut1和glut3表达的影响[j]，《中国病理生理杂志》2010年11期）。
[0004]
由于3-硝基丙酸的药理性能发现，3-硝基丙酸的需求量越来越多，利用微生物菌株产3-硝基丙酸也是一种常规的方法，目前也有一些关于节菱孢产毒的研究。罗雪云等人从麦芽汁、马铃薯汁、蛋白胨、酵母膏和蔗糖等成份组成的培养基中，筛选出麦芽汁-蛋白胨、麦芽汁-酵母膏和马铃薯-酵母膏-蔗糖三种节菱孢产毒培养基。节菱孢产毒株的三种培养物对小鼠的ld_(50)分别为54.0ml/kg、55.0ml/kg和52.0ml/kg（罗雪云,刘兴玠,李玉伟,李秀芳.变质甘蔗中毒的病因研究——-.节菱孢产毒培养基的研究，《卫生研究》，1986，15
(3)-25）。刘江等人采用正交试验设计研究了影响产毒节菱孢产毒的因素，按照实验室中影响产毒因素的影响程度的大小排列顺序为菌株温度>时间>培养基>ph值。培养基选择：土豆汁-酵母膏-蔗糖培养基（pys）、麦芽汁-蛋白胨培养基、麦芽汁-酵母膏培养基、甘蔗汁培养基，其中甘蔗汁由市售甘蔗去皮、粉碎、纱布挤汁制成(刘江,刘兴玠,孟昭赫.影响节菱孢产毒因素的实验室研究，《卫生研究》，1992，21(06)-303。
[0005]
节菱孢菌主要来自变质的甘蔗，但是从变质甘蔗中分离出节菱孢菌的成本高，因此，如何加快节菱孢菌的繁育成为了培养更多节菱孢菌的关键，目前对于节菱孢霉菌的研究主要集中在加快节菱孢菌产毒方面，而对于如何加快节菱孢菌产孢却极少有研究。因此，本申请人在如何加快节菱孢菌产孢方面进行了深入的研究。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种促进节菱孢菌高效产孢的培养基及其方法，采用本发明的培养基及其培养方法对节菱孢菌进行培养，可以促进节菱孢菌高效产孢，快速获得产孢的节菱孢菌用于扩繁，最快7天即可获得产孢的节菱孢菌，完成一代繁殖进入下一代的扩繁。将本发明的培养基及其培养方法用于节菱孢菌的扩繁，能极大地缩短节菱孢菌的扩繁周期。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养6-8d，将经过活化培养的节菱孢菌株接种至甘蔗汁培养基或马铃薯汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在27-29℃下恒温培养7-15d，即可获得产孢的节菱孢菌。
[0008]
进一步，还能将所获得的产孢的节菱孢菌接种至新的甘蔗汁培养基或马铃薯汁培养基上进一步用于扩繁，连续进行扩繁多代，繁育更多的节菱孢菌后代。
[0009]
所述甘蔗汁培养基含以下配比物质：甘蔗汁30-100g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l；将各原料按配比混合后于121℃、105kpa下灭菌20min即得到甘蔗汁培养基；所述甘蔗汁由甘蔗茎经榨汁后过滤得到。
[0010]
优选地，所述甘蔗汁培养基含以下配比物质：甘蔗汁50g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l。
[0011]
所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯50-400g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l；将马铃薯切成小块后置于沸水中煮20-40min，用纱布过滤得到马铃薯汁；再将马铃薯汁与葡萄糖和琼脂按配比混合均匀后于121℃、105kpa下灭菌20min即得到马铃薯汁培养基。
[0012]
优选地，所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯100g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。
[0013]
本发明的有益效果是：本发明的甘蔗汁培养基或马铃薯汁培养基原料少、成本低且制备方法简单，采用本发明的培养基及其培养方法对节菱孢菌进行培养，可以促进节菱孢菌高效产孢，快速获得产孢的节菱孢菌用于扩繁，最快7天即可获得产孢的节菱孢菌，完成一代繁殖进入下一代的扩繁。将本发明的培养基及其培养方法用于节菱孢菌的扩繁，能极大地缩短节菱孢菌的扩繁周期。
附图说明
[0014]
图1是用实施例1含甘蔗汁30g/l的甘蔗汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图2是用实施例2含甘蔗汁50g/l的甘蔗汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图3是用实施例3含甘蔗汁100g/l的甘蔗汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图4是用实施例4含马铃薯50g/l的马铃薯汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图5是用实施例5含马铃薯100g/l的马铃薯汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图6是用实施例6含马铃薯200g/l的马铃薯汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图7是用实施例7含马铃薯400g/l的马铃薯汁培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图8是用对比实施例1的psa培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图；图9是用对比实施例2的玉米淀粉培养基培养7天得到的节菱孢菌生长情况展示图。
具体实施方式
[0015]
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。以下所提到的节菱孢菌种都是本申请人从市售的甘蔗中分离出来并保存起来得到的。
[0016]
实施例1一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至甘蔗汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0017]
所述甘蔗汁培养基含以下配比物质：甘蔗汁30g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l。将甘蔗茎经榨汁后过滤得到甘蔗汁，取30g新鲜压榨的甘蔗汁加入七水硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾1.0g、琼脂20g，搅拌均匀使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到甘蔗汁培养基。
[0018]
实施例2一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至甘蔗汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0019]
所述甘蔗汁培养基含以下配比物质：甘蔗汁50g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l。将甘蔗茎经榨汁后过滤得到甘蔗汁，取50g新鲜压榨的甘蔗汁加入七水硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾1.0g、琼脂20g，搅拌均匀使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到甘蔗汁培养基。
[0020]
实施例3一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培
养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至甘蔗汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0021]
所述甘蔗汁培养基含以下配比物质：甘蔗汁100g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l。将甘蔗茎经榨汁后过滤得到甘蔗汁，取100g新鲜压榨的甘蔗汁加入七水硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾1.0g、琼脂20g，搅拌均匀使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到甘蔗汁培养基。
[0022]
实施例4一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至马铃薯汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0023]
所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯50g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。取马铃薯50g切成约2cm
×
2cm的小块后置于沸水中煮30min，用纱布过滤得到马铃薯汁；往马铃薯汁中加入葡萄糖20g和琼脂20g使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到马铃薯汁培养基。
[0024]
实施例5一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至马铃薯汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0025]
所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯100g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。取马铃薯100g切成约2cm
×
2cm的小块后置于沸水中煮30min，用纱布过滤得到马铃薯汁；往马铃薯汁中加入葡萄糖20g和琼脂20g使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到马铃薯汁培养基。
[0026]
实施例6一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至马铃薯汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0027]
所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。取马铃薯200g切成约2cm
×
2cm的小块后置于沸水中煮30min，用纱布过滤得到马铃薯汁；往马铃薯汁中加入葡萄糖20g和琼脂20g使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到马铃薯汁培养基。所述含马铃薯200g/l的马铃薯汁培养基即pda 培养基。
[0028]
实施例7一种促进节菱孢菌高效产孢的方法，步骤如下：将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至马铃薯汁培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0029]
所述马铃薯汁培养基含以下配比物质：马铃薯400g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。取马铃薯400g切成约2cm
×
2cm的小块后置于沸水中煮30min，用纱布过滤得到马铃薯汁；往马铃薯汁中加入葡萄糖20g和琼脂20g使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa下灭菌20min即得到马铃薯汁培养基。
[0030]
为了突出本发明的培养基能促进节菱孢菌高效产孢，本申请人还使用其他常用的培养基进行了以下试验：对比实施例1将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至psa培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0031]
所述psa培养基含以下配比物质：马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l。取马铃薯200g切成约2cm
×
2cm的小块后置于沸水中煮30min，用纱布过滤得到马铃薯汁；往马铃薯汁中加入蔗糖20g和琼脂20g使各成分完全溶解并加水定容至1l，再将溶液于121℃、105kpa 下灭菌20min即得到psa培养基。
[0032]
对比实施例2将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至玉米淀粉培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0033]
所述玉米淀粉培养基( cs，基础培养基) 含以下配比物质：玉米淀粉3g/l，七水硫酸镁1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，琼脂20g/l。按常规方法将各原料按配比混合均匀后于121℃、105kpa下灭菌20min即得到玉米淀粉培养基。
[0034]
对比实施例3将节菱孢菌种在 pda 培养基上活化培养7d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼接种至sna培养基中，然后放入恒温培养箱中在28℃下恒温培养15d。
[0035]
所述sna培养基含以下配比物质：磷酸二氢钾1.0g/l，硝酸钾1.0g/l，氯化钾0.5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，蔗糖0.2g/l，葡萄糖0.2g/l，琼脂20g/l。按常规方法将各原料按配比混合均匀后于121℃、105kpa 下灭菌20min即得到sna培养基。
[0036]
经活化培养并接种至新的培养基后，定时观测以上各培养基上节菱孢菌的产孢量，观测方法为：用直径为5mm的打孔器在培养基菌落上打菌饼1个，置于1ml无菌水中制成孢子悬浮液，用血球计数板在显微镜下观测孢子数量。以上10个实施例培养的节菱孢菌的产孢时间及其产孢量记录如下：从以上产孢时间及产孢数量来看，实施例1-5的培养基上节菱孢菌株都能在第7天产
孢，开始产孢时间较早，其中实施例2和实施例5的培养基产孢效果最佳，不仅产孢时间早且产孢数量多，最适合用于节菱孢菌的扩繁。
[0037]
第7天各培养基上节菱孢菌株的生长情况见图1-9，可见，当培养基中甘蔗汁和马铃薯汁的含量越高，菌株的长势越好，但是节菱孢菌株长势好不代表其产孢数量多。而接种至玉米淀粉培养基上的菌株不生长，接种至sna培养基上的菌株仅在原接种位置生长而不扩散生长，产孢量太少无法测定。

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