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2021-02-02 11:02:56|
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起点商标网 一种利用类球红细菌发酵生产辅酶q10的培养基和培养方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用类球红细菌发酵生产辅酶q10的培养基和培养方法。
背景技术：
[0002]
辅酶q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。
[0003]
目前，国内辅酶q10的发酵生产采用三级发酵模式，其工艺过程为：将辅酶q10生产菌种经摇瓶培养，接入一级种子罐进行培养，符合移种条件后转入二级种子罐进行培养，od值（分光光度计测定）至3～4%时移种，接入发酵罐进行发酵培养，当发酵单位达到2000mg/l以上，停止发酵。该方式存在的主要问题有以下几点：1 国内辅酶q10发酵技术水平较低，其发酵水平普遍维持在2500～3000mg/l。
[0004]
2 国内大多数辅酶q10生产企业使用葡萄糖作为碳源发酵生产辅酶q10。由于葡萄糖高温条件下容易碳化，含葡萄糖的培养基经高温灭菌后，容易产生有害物质，影响了辅酶q10生产菌种的发酵技术水平。
[0005]
3 辅酶q10培养基中的碳源是葡萄糖，氮源主要是黄豆粉、酵母提取物、蛋白胨或牛肉膏，培养基配方成本较高。
技术实现要素：
[0006]
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种能够有效提高发酵水平，降低生产成本，实现辅酶q10稳定、高效生产的培养基。
[0007]
本发明的另一目的是提供上述利用培养基制备辅酶q10的培养方法。
[0008]
为实现上述目的所采取的技术方案为：一种利用类球红细菌发酵生产辅酶q10的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中所述一级种子培养基的组成为：糖蜜发酵液20～24kg/m
3
、一级花生粕19～23kg/m
3
、苜蓿粉8～12kg/m
3
、ddgs 13～17kg/m
3
、硫酸铵0.4～0.8kg/m
3
、轻质碳酸钙1～3kg/m
3
；所述二级种子培养基的组成为：糖蜜发酵液22～26kg/m
3
、一级花生粕21～25kg/m
3
、苜蓿粉10～14kg/m
3
、ddgs 15～19kg/m
3
、蚕蛹蛋白7～11kg/m
3
、硫酸铵0.5～0.9kg/m
3
、轻质碳酸钙1～3kg/m
3
；所述发酵培养基的组成为：糖蜜发酵液41～45kg/m
3
、一级花生粕22～26kg/m
3
、苜蓿粉11～15kg/m
3
、ddgs 16～20kg/m
3
、蚕蛹蛋白9～13kg/m
3
、硫酸铵0.5～0.9kg/m
3
、轻质碳酸钙1～5kg/m
3
、磷酸二氢钾0.04～0.08kg/m
3
、硫酸镁0.02～0.06kg/m
3
、硫酸亚铁0.08～0.12kg/m
3
、氯化钴0.01～
0.03kg/m
3
、炔二醇改性表面活性剂3～7l/m
3
。
[0009]
一种利用上述的培养基发酵生产辅酶q10的培养方法，其特征在于工艺步骤为：1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0～6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，od值至3～4时移种；2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0～6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，od值）至3～4时移种，移入发酵培养基；3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4～6.6，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至发酵单位＞3500mg/l时终止发酵。
[0010]
所述一级种子培养条件为：罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120～140r/min；空气流速：100～200m
3
/h。
[0011]
所述二级种子培养条件为：罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量200～400m
3
/h；搅拌转速120～140r/min。
[0012]
所述发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140～160r/min。
[0013]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：600～800m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0014]
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补糖蜜发酵液和补磷，其中a补水工艺控制：发酵过程中，发酵液体积低于发酵罐有效容积的65%时，加入灭菌水，至发酵液体积为70%时，停止补水；b 补磷工艺：发酵时间在4～28h，若补入3-5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在7-8l/h，发酵时间在42～80h，若补入3-5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在4-5l/h；c 补入糖蜜发酵液：发酵时间在0～48h，当总糖含量＜0.8%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.8～1.5%，发酵时间在48～80h，当总糖含量＜0.5%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.5～0.8%，
d 补硫酸铵：发酵时间在48～80h，发酵液中氨氮含量＜0.2%时，补入已灭菌的20～30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.4～0.5%。
[0015]
相关研究显示：根据辅酶q10生化合成原理，增加关键氨基酸如蛋氨酸、精氨酸、异亮氨酸含量，会提高辅酶q10发酵单位，其它氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，含量过高则会影响辅酶q10生化合成，降低发酵单位。另外，辅酶10的前体是甲硫氨酸和s-腺苷蛋氨酸、微生物b1，添加生长因子如vb1、vb2、烟叶、豆油、豆粉、胡萝卜汁、西红柿汁、β-胡萝卜素、桔子皮汁会提高辅酶q10发酵单位。
[0016]
基于上述，本发明在辅酶q10培养基组成中添加糖蜜发酵液、花生粕、苜蓿粉、ddgs、蚕蛹蛋白等，各物质所具有的优势为：1.糖蜜发酵液糖蜜发酵液是以糖蜜为主要原料，再由蜜糖、氮、磷、钙、钠、微量元素、多种维生素和氨基酸等营养元素组成的培养基中加入发酵菌种，在发酵罐中的无菌条件下进行封闭发酵。提取发酵后的培养基经过低温脱水、蒸发浓缩后形成糖蜜发酵液。
[0017]
经检测：葡萄糖含量在48%，叶酸：>300ng/g，维生素b12: >160ng/g，蛋白含量：25%，其中蛋氨酸1.32%，异亮氨酸0.76%，其它：钙1.2%，铁210ppm，锰104ppm，锌45ppm。
[0018]
2.一级花生粕花生粕与黄豆粉相比，不仅蛋白质含量高、脂肪含量少，而且没有经过高温处理，蛋白质变性程度小，水分含量低。其中粗蛋白含量超过了50%，而且精氨酸含量达到了5%。
[0019]
3.苜蓿粉苜蓿粉含蛋白质5%，糖类8%，胡萝卜素0.3%，维生素b2为0.04%，磷0.05%，铁0.03%，此外还含有维生素k。
[0020]
4.ddgsddgs饲料，是酒糟中蛋白饲料的商品名，即含有可溶固形物的干酒糟。在以玉米为原料发酵制取乙醇过程中，其中的淀粉被转化成乙醇和二氧化碳，其他营养成分如蛋白质、脂肪、纤维等均留在酒糟中。同时由于微生物的作用，酒糟中蛋白质、b族维生素及氨基酸含量均比玉米有所增加，并含有发酵中生成的未知促生长因子。
[0021]
ddgs中蛋白质含量在26%以上，其中蛋氨酸0.5%，异亮氨酸1.12%。
[0022]
5.蚕蛹蛋白蚕蛹蛋白含量在50％以上，而且蛋白质中的必需氨基酸种类齐全，其中甲硫氨酸、异亮氨酸含量较高。
[0023]
本发明将上述原料配比后作为辅酶q10培养基组成，其中控制种子培养基c/n比例是：碳源含量约占种子培养基配方30～40%，发酵培养基c/n比例是：碳源含量约占培养基配方40～50%。本发明利用上述配比的培养基组成发酵生产辅酶q10，技术优势体现在：1.本发明采用1 糖蜜发酵液替代葡萄糖，避免了培养基高温消毒带来的不利因素。
[0024]
2.本发明采用糖蜜发酵液代替葡萄糖或蔗糖或麦芽糖；一级花生粕、苜蓿粉、ddgs和蚕蛹蛋白替代黄豆粉、酵母、牛肉膏或蛋白胨，降低了培养基成本。
[0025]
3.本发明确认了发酵生产辅酶q10的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是发酵培养基中添加了一级花生粕、苜蓿粉、ddgs和蚕蛹蛋白，这四种物质
中含有生物合成辅酶q10的关键氨基酸、微量元素、前体和生长因子，保证了辅酶q10的发酵技术效果。
[0026]
4.本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了辅酶q10最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产辅酶q10，其发酵单位达到3500mg/l以上，同国内技术相比，发酵单位提高了16%以上。
[0027]
具体实施方法下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
[0028]
下述实施例的菌种选用类球红细菌（菌种编号：cicc10287），生产使用的菌种来源为球红细菌摇瓶液。
[0029]
下述实施例中，摇瓶液的接种量按照常规技术的接种量，一级种子罐接种量通常为1～2l/m
3
。
[0030]
实施例1一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液20kg、一级花生粕19kg、苜蓿粉8kg、ddgs 13kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙1kg。
[0031]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：100m
3
/h。od值至3.1时移种。
[0032]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液220kg、一级花生粕210kg、苜蓿粉100kg、ddgs 150kg、蚕蛹蛋白70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙10kg。
[0033]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量200m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3时移种，移入发酵培养基。
[0034]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4100kg、一级花生粕2200kg、苜蓿粉1100kg/m
3
、ddgs 1600kg、蚕蛹蛋白900kg、硫酸铵50kg
3
、轻质碳酸钙100kg；磷酸二氢钾4kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁8kg、氯化钴1kg、炔二醇改性表面活性剂300l。
[0035]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0036]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0037]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：600m
3
/h；
f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0038]
发酵单位3546mg/l时停止发酵。
[0039]
实施例2一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液21kg、一级花生粕20kg、苜蓿粉9kg、ddgs 14kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1.5kg。
[0040]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.2l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：125r/min；空气流速：130m
3
/h。od值至3.3时移种。
[0041]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液230kg、一级花生粕220kg、苜蓿粉110kg、ddgs 160kg、蚕蛹蛋白80kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙15kg。
[0042]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速125r/min。od值（分光光度计测定）至3.3时移种，移入发酵培养基；发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4200kg、一级花生粕2300kg、苜蓿粉1200kg/m
3
、ddgs 1700kg、蚕蛹蛋白1000kg、硫酸铵60kg
3
、轻质碳酸钙200kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁9kg、氯化钴1.5kg、炔二醇改性表面活性剂400l。
[0043]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0044]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：145r/min。
[0045]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：650m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0046]
发酵单位3589mg/l时停止发酵。
[0047]
实施例3一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液22kg、一级花生粕21kg、苜蓿粉10kg、ddgs 15kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
[0048]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：135r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.5时移种。
[0049]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液240kg、一级花生粕230kg、苜蓿粉120kg、ddgs 170kg、蚕蛹蛋白90kg、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙20kg。
[0050]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量300m
3
/h；搅拌转速130r/min。od值（分光光度计测定）至3.5时移种，移入发酵培养基。
[0051]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4300kg、一级花生粕2400kg、苜蓿粉1300kg/m
3
、ddgs 1800kg、蚕蛹蛋白1100kg、硫酸铵70kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁4kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴2kg、炔二醇改性表面活性剂500l。
[0052]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0053]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：145r/min。
[0054]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0055]
发酵单位3672mg/l时停止发酵。
[0056]
实施例4一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液23kg、一级花生粕22kg、苜蓿粉11kg、ddgs 16kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙2.5kg。
[0057]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.7l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：138r/min；空气流速：180m
3
/h。od值至3.7时移种。
[0058]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液250kg、一级花生粕240kg、苜蓿粉130kg、ddgs 180kg、蚕蛹蛋白100kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙25kg。
[0059]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无
菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量350m
3
/h；搅拌转速135r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0060]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4400kg、一级花生粕2500kg、苜蓿粉1400kg/m
3
、ddgs 1900kg、蚕蛹蛋白1200kg、硫酸铵80kg
3
、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁11kg、氯化钴2.5kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0061]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0062]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0063]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：750m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0064]
发酵单位3659mg/l时停止发酵。
[0065]
实施例5一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液24kg、一级花生粕23kg、苜蓿粉12kg、ddgs 17kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙3kg；一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液2l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：140r/min；空气流速：200m
3
/h。od值至4时移种。
[0066]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液260kg、一级花生粕250kg、苜蓿粉140kg、ddgs 190kg、蚕蛹蛋白110kg、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙30kg。
[0067]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量400m
3
/h；搅拌转速140r/min。od值（分光光度计测定）至4时移种，移入发酵培养基。
[0068]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4500kg、一级花生粕2600kg、苜蓿粉1500kg/m
3
、ddgs 2000kg、蚕蛹蛋白1300kg、硫酸铵90kg
3
、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾8kg、硫酸镁6kg、硫酸亚铁12kg、氯化钴3kg、炔二醇改性表面活性剂700l。
[0069]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，
然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0070]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：160r/min。
[0071]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：800m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0072]
发酵单位3574mg/l时停止发酵。
[0073]
实施例6一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液20kg、一级花生粕23kg、苜蓿粉12kg、ddgs 17kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙1kg。
[0074]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.3l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：120m
3
/h。od值至3.3时移种。
[0075]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液220kg、一级花生粕250kg、苜蓿粉140kg、ddgs 190kg、蚕蛹蛋白110kg、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙30kg。
[0076]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量220m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3.2时移种，移入发酵培养基。
[0077]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4100kg、一级花生粕2600kg、苜蓿粉1500kg/m
3
、ddgs 2000kg、蚕蛹蛋白1300kg、硫酸铵90kg
3
、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴1.6kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0078]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0079]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0080]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：650m
3
/h；f 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0081]
发酵单位3528mg/l时停止发酵。
[0082]
实施例7一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液24kg、一级花生粕19kg、苜蓿粉8kg、ddgs 13kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
[0083]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：130r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.5时移种。
[0084]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液260kg、一级花生粕210kg、苜蓿粉100kg、ddgs 150kg、蚕蛹蛋白70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙25kg。
[0085]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速130r/min。od值（分光光度计测定）至3.6时移种，移入发酵培养基。
[0086]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4500kg、一级花生粕2200kg、苜蓿粉1100kg/m
3
、ddgs 1600kg、蚕蛹蛋白900kg、硫酸铵50kg
3
、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁9kg、氯化钴1.2kg、炔二醇改性表面活性剂500l。
[0087]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0088]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0089]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0090]
发酵单位3507mg/l时停止发酵。
[0091]
实施例8一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液22kg、一级花生粕22kg、苜蓿粉11kg、ddgs 16kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg。
[0092]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.7，并用无
菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.8l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：140r/min；空气流速：180m
3
/h。od值至3.9时移种。
[0093]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液230kg、一级花生粕240kg、苜蓿粉130kg、ddgs 180kg、蚕蛹蛋白120kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙20kg。
[0094]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.7，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量320m
3
/h；搅拌转速135r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0095]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4200kg、一级花生粕2500kg、苜蓿粉1400kg/m
3
、ddgs 1900kg、蚕蛹蛋白1200kg、硫酸铵80kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴1.4kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0096]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0097]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0098]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：750m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0099]
发酵单位3523mg/l时停止发酵。
[0100]
实施例9一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液23kg、一级花生粕20kg、苜蓿粉9kg、ddgs 14kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1.3kg。
[0101]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.4l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：130r/min；空气流速：200m
3
/h。od值至3.6时移种。
[0102]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液250kg、一级花生粕220kg、苜蓿粉120kg、ddgs 170kg、蚕蛹蛋白100kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙12kg。
[0103]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，
罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量240m
3
/h；搅拌转速140r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0104]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4400kg、一级花生粕2300kg、苜蓿粉1200kg/m
3
、ddgs 1700kg、蚕蛹蛋白1000kg、硫酸铵60kg
3
、轻质碳酸钙350kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁11kg、氯化钴2.4kg、炔二醇改性表面活性剂700l。
[0105]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0106]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0107]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：780m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0108]
发酵单位3560mg/l时停止发酵。
[0109]
上述实施例1～9的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补糖蜜发酵液和补磷，其中a补水工艺控制：发酵过程中，发酵液体积低于发酵罐有效容积的65%时，加入灭菌水，至发酵液体积为70%时，停止补水。
[0110]
b 补磷工艺：发酵时间在4～28h，若补入3～5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在7～8l/h；发酵时间在42～80h，若补入3～5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在4～5l/h。
[0111]
c 补入糖蜜发酵液：发酵时间在0～48h，当总糖含量＜0.8%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.8～1.5%，发酵时间在48～80h，当总糖含量＜0.5%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.5～0.8%。
[0112]
d 补硫酸铵：发酵时间在48～80h，发酵液中氨氮含量＜0.2%时，补入已灭菌的20-30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.4～0.5%。
[0113]
对比实施例（培养工艺及控制参数依据实施例3）对比实施例1一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖20kg、麦芽提取物8kg、黄豆粉23kg、玉米浆15kg、酵母提取物14kg，硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1kg。
[0114]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.6时移种。
[0115]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖220kg、麦芽提取物90kg、黄豆粉210kg、玉米浆100kg、酵母提取物150kg、琼脂70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙10kg。
[0116]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3.6时移种，移入发酵培养基。
[0117]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖3800kg、麦芽提取物600kg、黄豆粉2200kg、玉米浆1100kg/m
3
、酵母提取物1600kg、琼脂900kg、硫酸铵45kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁7kg、氯化钴1.5kg、羟基苯甲酸酯1.3kg，胡萝卜素1.3kg，硅油消泡剂300l。
[0118]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0119]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0120]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0121]
发酵单位2861mg/l时停止发酵。
技术领域
[0001]
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用类球红细菌发酵生产辅酶q10的培养基和培养方法。
背景技术：
[0002]
辅酶q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。
[0003]
目前，国内辅酶q10的发酵生产采用三级发酵模式，其工艺过程为：将辅酶q10生产菌种经摇瓶培养，接入一级种子罐进行培养，符合移种条件后转入二级种子罐进行培养，od值（分光光度计测定）至3～4%时移种，接入发酵罐进行发酵培养，当发酵单位达到2000mg/l以上，停止发酵。该方式存在的主要问题有以下几点：1 国内辅酶q10发酵技术水平较低，其发酵水平普遍维持在2500～3000mg/l。
[0004]
2 国内大多数辅酶q10生产企业使用葡萄糖作为碳源发酵生产辅酶q10。由于葡萄糖高温条件下容易碳化，含葡萄糖的培养基经高温灭菌后，容易产生有害物质，影响了辅酶q10生产菌种的发酵技术水平。
[0005]
3 辅酶q10培养基中的碳源是葡萄糖，氮源主要是黄豆粉、酵母提取物、蛋白胨或牛肉膏，培养基配方成本较高。
技术实现要素：
[0006]
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种能够有效提高发酵水平，降低生产成本，实现辅酶q10稳定、高效生产的培养基。
[0007]
本发明的另一目的是提供上述利用培养基制备辅酶q10的培养方法。
[0008]
为实现上述目的所采取的技术方案为：一种利用类球红细菌发酵生产辅酶q10的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中所述一级种子培养基的组成为：糖蜜发酵液20～24kg/m
3
、一级花生粕19～23kg/m
3
、苜蓿粉8～12kg/m
3
、ddgs 13～17kg/m
3
、硫酸铵0.4～0.8kg/m
3
、轻质碳酸钙1～3kg/m
3
；所述二级种子培养基的组成为：糖蜜发酵液22～26kg/m
3
、一级花生粕21～25kg/m
3
、苜蓿粉10～14kg/m
3
、ddgs 15～19kg/m
3
、蚕蛹蛋白7～11kg/m
3
、硫酸铵0.5～0.9kg/m
3
、轻质碳酸钙1～3kg/m
3
；所述发酵培养基的组成为：糖蜜发酵液41～45kg/m
3
、一级花生粕22～26kg/m
3
、苜蓿粉11～15kg/m
3
、ddgs 16～20kg/m
3
、蚕蛹蛋白9～13kg/m
3
、硫酸铵0.5～0.9kg/m
3
、轻质碳酸钙1～5kg/m
3
、磷酸二氢钾0.04～0.08kg/m
3
、硫酸镁0.02～0.06kg/m
3
、硫酸亚铁0.08～0.12kg/m
3
、氯化钴0.01～
0.03kg/m
3
、炔二醇改性表面活性剂3～7l/m
3
。
[0009]
一种利用上述的培养基发酵生产辅酶q10的培养方法，其特征在于工艺步骤为：1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0～6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液接入一级种子培养基中进行一级种子培养，od值至3～4时移种；2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0～6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，od值）至3～4时移种，移入发酵培养基；3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4～6.6，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至发酵单位＞3500mg/l时终止发酵。
[0010]
所述一级种子培养条件为：罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120～140r/min；空气流速：100～200m
3
/h。
[0011]
所述二级种子培养条件为：罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量200～400m
3
/h；搅拌转速120～140r/min。
[0012]
所述发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140～160r/min。
[0013]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：600～800m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0014]
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补糖蜜发酵液和补磷，其中a补水工艺控制：发酵过程中，发酵液体积低于发酵罐有效容积的65%时，加入灭菌水，至发酵液体积为70%时，停止补水；b 补磷工艺：发酵时间在4～28h，若补入3-5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在7-8l/h，发酵时间在42～80h，若补入3-5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在4-5l/h；c 补入糖蜜发酵液：发酵时间在0～48h，当总糖含量＜0.8%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.8～1.5%，发酵时间在48～80h，当总糖含量＜0.5%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.5～0.8%，
d 补硫酸铵：发酵时间在48～80h，发酵液中氨氮含量＜0.2%时，补入已灭菌的20～30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.4～0.5%。
[0015]
相关研究显示：根据辅酶q10生化合成原理，增加关键氨基酸如蛋氨酸、精氨酸、异亮氨酸含量，会提高辅酶q10发酵单位，其它氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，含量过高则会影响辅酶q10生化合成，降低发酵单位。另外，辅酶10的前体是甲硫氨酸和s-腺苷蛋氨酸、微生物b1，添加生长因子如vb1、vb2、烟叶、豆油、豆粉、胡萝卜汁、西红柿汁、β-胡萝卜素、桔子皮汁会提高辅酶q10发酵单位。
[0016]
基于上述，本发明在辅酶q10培养基组成中添加糖蜜发酵液、花生粕、苜蓿粉、ddgs、蚕蛹蛋白等，各物质所具有的优势为：1.糖蜜发酵液糖蜜发酵液是以糖蜜为主要原料，再由蜜糖、氮、磷、钙、钠、微量元素、多种维生素和氨基酸等营养元素组成的培养基中加入发酵菌种，在发酵罐中的无菌条件下进行封闭发酵。提取发酵后的培养基经过低温脱水、蒸发浓缩后形成糖蜜发酵液。
[0017]
经检测：葡萄糖含量在48%，叶酸：>300ng/g，维生素b12: >160ng/g，蛋白含量：25%，其中蛋氨酸1.32%，异亮氨酸0.76%，其它：钙1.2%，铁210ppm，锰104ppm，锌45ppm。
[0018]
2.一级花生粕花生粕与黄豆粉相比，不仅蛋白质含量高、脂肪含量少，而且没有经过高温处理，蛋白质变性程度小，水分含量低。其中粗蛋白含量超过了50%，而且精氨酸含量达到了5%。
[0019]
3.苜蓿粉苜蓿粉含蛋白质5%，糖类8%，胡萝卜素0.3%，维生素b2为0.04%，磷0.05%，铁0.03%，此外还含有维生素k。
[0020]
4.ddgsddgs饲料，是酒糟中蛋白饲料的商品名，即含有可溶固形物的干酒糟。在以玉米为原料发酵制取乙醇过程中，其中的淀粉被转化成乙醇和二氧化碳，其他营养成分如蛋白质、脂肪、纤维等均留在酒糟中。同时由于微生物的作用，酒糟中蛋白质、b族维生素及氨基酸含量均比玉米有所增加，并含有发酵中生成的未知促生长因子。
[0021]
ddgs中蛋白质含量在26%以上，其中蛋氨酸0.5%，异亮氨酸1.12%。
[0022]
5.蚕蛹蛋白蚕蛹蛋白含量在50％以上，而且蛋白质中的必需氨基酸种类齐全，其中甲硫氨酸、异亮氨酸含量较高。
[0023]
本发明将上述原料配比后作为辅酶q10培养基组成，其中控制种子培养基c/n比例是：碳源含量约占种子培养基配方30～40%，发酵培养基c/n比例是：碳源含量约占培养基配方40～50%。本发明利用上述配比的培养基组成发酵生产辅酶q10，技术优势体现在：1.本发明采用1 糖蜜发酵液替代葡萄糖，避免了培养基高温消毒带来的不利因素。
[0024]
2.本发明采用糖蜜发酵液代替葡萄糖或蔗糖或麦芽糖；一级花生粕、苜蓿粉、ddgs和蚕蛹蛋白替代黄豆粉、酵母、牛肉膏或蛋白胨，降低了培养基成本。
[0025]
3.本发明确认了发酵生产辅酶q10的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是发酵培养基中添加了一级花生粕、苜蓿粉、ddgs和蚕蛹蛋白，这四种物质
中含有生物合成辅酶q10的关键氨基酸、微量元素、前体和生长因子，保证了辅酶q10的发酵技术效果。
[0026]
4.本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了辅酶q10最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产辅酶q10，其发酵单位达到3500mg/l以上，同国内技术相比，发酵单位提高了16%以上。
[0027]
具体实施方法下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
[0028]
下述实施例的菌种选用类球红细菌（菌种编号：cicc10287），生产使用的菌种来源为球红细菌摇瓶液。
[0029]
下述实施例中，摇瓶液的接种量按照常规技术的接种量，一级种子罐接种量通常为1～2l/m
3
。
[0030]
实施例1一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液20kg、一级花生粕19kg、苜蓿粉8kg、ddgs 13kg、硫酸铵0.4kg、轻质碳酸钙1kg。
[0031]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：100m
3
/h。od值至3.1时移种。
[0032]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液220kg、一级花生粕210kg、苜蓿粉100kg、ddgs 150kg、蚕蛹蛋白70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙10kg。
[0033]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量200m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3时移种，移入发酵培养基。
[0034]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4100kg、一级花生粕2200kg、苜蓿粉1100kg/m
3
、ddgs 1600kg、蚕蛹蛋白900kg、硫酸铵50kg
3
、轻质碳酸钙100kg；磷酸二氢钾4kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁8kg、氯化钴1kg、炔二醇改性表面活性剂300l。
[0035]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0036]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0037]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：600m
3
/h；
f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0038]
发酵单位3546mg/l时停止发酵。
[0039]
实施例2一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液21kg、一级花生粕20kg、苜蓿粉9kg、ddgs 14kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1.5kg。
[0040]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.2l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：125r/min；空气流速：130m
3
/h。od值至3.3时移种。
[0041]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液230kg、一级花生粕220kg、苜蓿粉110kg、ddgs 160kg、蚕蛹蛋白80kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙15kg。
[0042]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速125r/min。od值（分光光度计测定）至3.3时移种，移入发酵培养基；发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4200kg、一级花生粕2300kg、苜蓿粉1200kg/m
3
、ddgs 1700kg、蚕蛹蛋白1000kg、硫酸铵60kg
3
、轻质碳酸钙200kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁9kg、氯化钴1.5kg、炔二醇改性表面活性剂400l。
[0043]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0044]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：145r/min。
[0045]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：650m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0046]
发酵单位3589mg/l时停止发酵。
[0047]
实施例3一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液22kg、一级花生粕21kg、苜蓿粉10kg、ddgs 15kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
[0048]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：135r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.5时移种。
[0049]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液240kg、一级花生粕230kg、苜蓿粉120kg、ddgs 170kg、蚕蛹蛋白90kg、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙20kg。
[0050]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量300m
3
/h；搅拌转速130r/min。od值（分光光度计测定）至3.5时移种，移入发酵培养基。
[0051]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4300kg、一级花生粕2400kg、苜蓿粉1300kg/m
3
、ddgs 1800kg、蚕蛹蛋白1100kg、硫酸铵70kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁4kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴2kg、炔二醇改性表面活性剂500l。
[0052]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0053]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：145r/min。
[0054]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0055]
发酵单位3672mg/l时停止发酵。
[0056]
实施例4一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液23kg、一级花生粕22kg、苜蓿粉11kg、ddgs 16kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙2.5kg。
[0057]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.7l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：138r/min；空气流速：180m
3
/h。od值至3.7时移种。
[0058]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液250kg、一级花生粕240kg、苜蓿粉130kg、ddgs 180kg、蚕蛹蛋白100kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙25kg。
[0059]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无
菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量350m
3
/h；搅拌转速135r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0060]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4400kg、一级花生粕2500kg、苜蓿粉1400kg/m
3
、ddgs 1900kg、蚕蛹蛋白1200kg、硫酸铵80kg
3
、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁11kg、氯化钴2.5kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0061]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0062]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0063]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：750m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0064]
发酵单位3659mg/l时停止发酵。
[0065]
实施例5一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液24kg、一级花生粕23kg、苜蓿粉12kg、ddgs 17kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙3kg；一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.8，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液2l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：140r/min；空气流速：200m
3
/h。od值至4时移种。
[0066]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液260kg、一级花生粕250kg、苜蓿粉140kg、ddgs 190kg、蚕蛹蛋白110kg、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙30kg。
[0067]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.8，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量400m
3
/h；搅拌转速140r/min。od值（分光光度计测定）至4时移种，移入发酵培养基。
[0068]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4500kg、一级花生粕2600kg、苜蓿粉1500kg/m
3
、ddgs 2000kg、蚕蛹蛋白1300kg、硫酸铵90kg
3
、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾8kg、硫酸镁6kg、硫酸亚铁12kg、氯化钴3kg、炔二醇改性表面活性剂700l。
[0069]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，
然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0070]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：160r/min。
[0071]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：800m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0072]
发酵单位3574mg/l时停止发酵。
[0073]
实施例6一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液20kg、一级花生粕23kg、苜蓿粉12kg、ddgs 17kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙1kg。
[0074]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.3l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：120m
3
/h。od值至3.3时移种。
[0075]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液220kg、一级花生粕250kg、苜蓿粉140kg、ddgs 190kg、蚕蛹蛋白110kg、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙30kg。
[0076]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量220m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3.2时移种，移入发酵培养基。
[0077]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4100kg、一级花生粕2600kg、苜蓿粉1500kg/m
3
、ddgs 2000kg、蚕蛹蛋白1300kg、硫酸铵90kg
3
、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴1.6kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0078]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0079]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0080]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：650m
3
/h；f 溶氧控制：
发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0081]
发酵单位3528mg/l时停止发酵。
[0082]
实施例7一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液24kg、一级花生粕19kg、苜蓿粉8kg、ddgs 13kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
[0083]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.6，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：130r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.5时移种。
[0084]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液260kg、一级花生粕210kg、苜蓿粉100kg、ddgs 150kg、蚕蛹蛋白70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙25kg。
[0085]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速130r/min。od值（分光光度计测定）至3.6时移种，移入发酵培养基。
[0086]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4500kg、一级花生粕2200kg、苜蓿粉1100kg/m
3
、ddgs 1600kg、蚕蛹蛋白900kg、硫酸铵50kg
3
、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁9kg、氯化钴1.2kg、炔二醇改性表面活性剂500l。
[0087]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0088]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0089]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0090]
发酵单位3507mg/l时停止发酵。
[0091]
实施例8一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液22kg、一级花生粕22kg、苜蓿粉11kg、ddgs 16kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg。
[0092]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.7，并用无
菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.8l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：140r/min；空气流速：180m
3
/h。od值至3.9时移种。
[0093]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液230kg、一级花生粕240kg、苜蓿粉130kg、ddgs 180kg、蚕蛹蛋白120kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙20kg。
[0094]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.7，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量320m
3
/h；搅拌转速135r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0095]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4200kg、一级花生粕2500kg、苜蓿粉1400kg/m
3
、ddgs 1900kg、蚕蛹蛋白1200kg、硫酸铵80kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁10kg、氯化钴1.4kg、炔二醇改性表面活性剂600l。
[0096]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0097]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：150r/min。
[0098]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：750m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0099]
发酵单位3523mg/l时停止发酵。
[0100]
实施例9一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：糖蜜发酵液23kg、一级花生粕20kg、苜蓿粉9kg、ddgs 14kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1.3kg。
[0101]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.4l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：130r/min；空气流速：200m
3
/h。od值至3.6时移种。
[0102]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
二级种子培养基组成：糖蜜发酵液250kg、一级花生粕220kg、苜蓿粉120kg、ddgs 170kg、蚕蛹蛋白100kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙12kg。
[0103]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，
罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量240m
3
/h；搅拌转速140r/min。od值（分光光度计测定）至3.8时移种，移入发酵培养基。
[0104]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
发酵培养基组成：糖蜜发酵液4400kg、一级花生粕2300kg、苜蓿粉1200kg/m
3
、ddgs 1700kg、蚕蛹蛋白1000kg、硫酸铵60kg
3
、轻质碳酸钙350kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁11kg、氯化钴2.4kg、炔二醇改性表面活性剂700l。
[0105]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.4，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0106]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0107]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：780m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0108]
发酵单位3560mg/l时停止发酵。
[0109]
上述实施例1～9的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补水、补硫酸铵、补糖蜜发酵液和补磷，其中a补水工艺控制：发酵过程中，发酵液体积低于发酵罐有效容积的65%时，加入灭菌水，至发酵液体积为70%时，停止补水。
[0110]
b 补磷工艺：发酵时间在4～28h，若补入3～5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在7～8l/h；发酵时间在42～80h，若补入3～5%磷酸二氢钾溶液，补入量控制在4～5l/h。
[0111]
c 补入糖蜜发酵液：发酵时间在0～48h，当总糖含量＜0.8%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.8～1.5%，发酵时间在48～80h，当总糖含量＜0.5%时，补入已灭菌的糖蜜发酵液，使总糖的含量控制在0.5～0.8%。
[0112]
d 补硫酸铵：发酵时间在48～80h，发酵液中氨氮含量＜0.2%时，补入已灭菌的20-30%硫酸铵溶液，使氨氮的含量控制在0.4～0.5%。
[0113]
对比实施例（培养工艺及控制参数依据实施例3）对比实施例1一级种子培养：一级种子液体积1m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖20kg、麦芽提取物8kg、黄豆粉23kg、玉米浆15kg、酵母提取物14kg，硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1kg。
[0114]
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.2，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的类球红细菌摇瓶液1.5l接入一级种子培养基中进行一级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；搅拌转速：120r/min；空气流速：150m
3
/h。od值至3.6时移种。
[0115]
二级种子培养：二级种子液体积10m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖220kg、麦芽提取物90kg、黄豆粉210kg、玉米浆100kg、酵母提取物150kg、琼脂70kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙10kg。
[0116]
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，ph控制在6.0，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，罐压0.02～0.06mpa；罐温31～32℃；空气流量250m
3
/h；搅拌转速120r/min。od值（分光光度计测定）至3.6时移种，移入发酵培养基。
[0117]
发酵培养：发酵培养基体积100m
3
一级种子培养基组成：葡萄糖3800kg、麦芽提取物600kg、黄豆粉2200kg、玉米浆1100kg/m
3
、酵母提取物1600kg、琼脂900kg、硫酸铵45kg
3
、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁7kg、氯化钴1.5kg、羟基苯甲酸酯1.3kg，胡萝卜素1.3kg，硅油消泡剂300l。
[0118]
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，ph控制在6.5，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
[0119]
发酵培养条件为：a ph：发酵过程中ph控制在6.2～6.6；b 温度：培养温度31～32℃；c 搅拌转速：140r/min。
[0120]
d 压力控制：罐压0.02～0.06mpa；e 空气流量：700m
3
/h；f 溶氧控制：发酵前20h内，不控制溶氧，发酵时间20h～发酵结束：溶氧控制在20%以上。
[0121]
发酵单位2861mg/l时停止发酵。
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