HI,欢迎来到起点商标网!
24小时服务QQ:2880605093

病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用的制作方法

2021-02-02 07:02:21|272|起点商标网
[0001]本发明涉及病毒检测领域,特别涉及病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用。
背景技术:
::[0002]新型冠状病毒是继2002年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和2012年暴发的中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)之后,过去20年间在人类中出现的第3种高致病冠状病毒。核酸的检测是病原诊断的一个依据,也是目前确诊新冠感染的一个重要的依据。因此,开展核酸病毒检测,也是病毒感染筛查、病毒疾病防控的重要手段。临床和实际应用过程中,不但对病毒检测方法的特异性、灵敏度和准确度具有较高的要求,同时对病毒检测技术的易用性和时效性也提出了较高的要求。此外,对病毒样本的处理、病毒核酸的提取方法也大大影响病毒的检测时间和准确度。[0003]目前的高通量新型冠状病毒核酸检测试剂盒基本采用反转录加实时聚合酶链式反应法(rt-pcr),扩增病原体的核酸(rna),同时通过荧光探针实时检测扩增产物。每个rt-pcr反应需要1.5-2小时的检测时间,特别是对检测灵敏度要求较高的(100cp/ml),一般需要核酸提取,通常最快3-4小时才可以报告结果。[0004]核酸恒温扩增技术(nucleicacidisothermalamplification,naia)则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行,对扩增所需仪器的要求大大简化,反应时间大大缩短,与pcr相比,该技术具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。在病毒核酸检测,筛查发具有很高的应用价值。然而,目前的恒温扩增技术均存在以下几个问题:(1)目前常用核酸提取技术提取流程复杂、时间长且核酸提取效率较低,无法满足临床检测需求;常用的病毒核酸提取纯化技术有trizol法、离心柱法、磁珠法等方法。trizol法利用dna、rna、蛋白质在有机层和水相层分布位置的不同而分离蛋白质与核酸,在获得核酸的过程中会用到苯酚、氯仿异戊醇、异丙醇、乙醇等对人体有害的挥发性有机溶剂,对操作人员存在较大的健康危害,且trizol法提取核酸步骤繁琐,对不同的样本提取效果重复性不佳,从样本裂解到获得核酸至少需要1.5h,其操作繁琐、耗时长,不宜在临床检测使用。常规的离心吸附柱及磁珠法提取核酸时需要用乙醇或异丙醇进行结合,需要加入乙醇清洗,这种加入醇类清洗的方式使得核酸提取试剂在使用时操作相对复杂,耗时较长,乙醇去除不干净还会抑制后续反应。[0005](2)等温扩增体系扩增效率极高,在对靶标的扩增过程中,不可避免的引入了不必要的非特异扩增,使得结果难以判断,对于非特异扩增,非特异性荧光染料掺入法对于产物的特异性也无能为力,需要对产物进一步的分析,如cas酶切鉴定等。但涉及开盖,极易造成气溶胶污染等环境污染,不利于临床检测使用。技术实现要素:[0006]有鉴于此,本发明提供了病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用。该试剂盒包含特异性好,灵敏度高的扩增引物。[0007]为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:本发明提供了病毒核酸提取或保存试剂,包括组分1和组分2;所述组分1包括磁珠;所述磁珠含有oligodt14-20;所述组分2为裂解保存液;所述裂解保存液包括如下组分:十二烷基硫酸锂0.01%~0.05%(w/w,质量百分比)tritonx-1000.5%~3%(v/v,体积百分比)异硫氰酸胍0.5m~1.5mtris0.01m~0.1mnacl0.1m~0.2m[0008]在本发明的一些具体实施方案中,所述的病毒核酸提取或保存试剂还包括组分3,所述组分3包括清洗液,所述清洗液包括如下组分:tritonx-1000.05%~0.2%(v/v,体积百分比)kcl0.05m~0.2m[0009]在本发明的一些具体实施方案中,所述的病毒核酸提取或保存试剂还包括组分4,所述组分4包括洗脱液,所述洗脱液包括如下组分:tris10mm~100mmedta1mm~10mm[0010]基于上述研究,本发明还提供了所述的病毒核酸提取或保存试剂在制备病毒核酸检测试剂盒中的应用;所述病毒包括新型冠状病毒covid-19。[0011]更重要的是,本发明还提供了引物探针组合,包括如下组合中的一种或两者以上:引物组合一:根据covid-19的n基因序列获得的rt-lamp的引物组合(1)、n1-f3:具有如seqidno.1所示的核苷酸序列;和(2)、n1-b3:具有如seqidno.2所示的核苷酸序列;和(3)、n1-fip:具有如seqidno.3所示的核苷酸序列;和(4)、n1-bip:具有如seqidno.4所示的核苷酸序列;和(5)、n1-lf:具有如seqidno.5所示的核苷酸序列;和(6)、n1-lb:具有如seqidno.6所示的核苷酸序列;或(7)、如(1)~(6)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(1)~(6)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(8)、与(1)~(6)任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列;和/或探针组合一:covid-19n基因荧光探针(9)、n-bhq1:具有如seqidno.7所示的核苷酸序列;和(10)、n-rox:具有如seqidno.8所示的核苷酸序列;或(11)、如(9)或(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(9)或(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(12)、与(9)或(10)所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列;和/或引物组合二:根据covid-19的orf基因序列获得的rt-lamp的引物组合(13)、19cov-orf-1-f3:具有如seqidno.9所示的核苷酸序列;和(14)、19cov-orf-1-b3:具有如seqidno.10所示的核苷酸序列;和(15)、19cov-orf-1-fip:具有如seqidno.11所示的核苷酸序列;和(16)、19cov-orf-1-bip:具有如seqidno.12所示的核苷酸序列;和(17)、19cov-orf-1-lf:具有如seqidno.13所示的核苷酸序列;和(18)、19cov-orf-1-lb:具有如seqidno.14所示的核苷酸序列;或(19)、如(13)~(18)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(13)~(18)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(20)、与(13)~(18)任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列;和/或探针组合二:covid-19orf基因荧光探针(21)、orf-bhq1:具有如seqidno.15所示的核苷酸序列;和(22)、orf-fam:具有如seqidno.16所示的核苷酸序列;或(23)、如(21)或(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(21)或(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(24)、与(21)或(22)所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列;和/或引物组合三:内参基因gapdh基因rt-lamp引物组合(25)、gapdh-f3-5p:具有如seqidno.17所示的核苷酸序列;和(26)、gapdh-b3-5p:具有如seqidno.18所示的核苷酸序列;和(27)、gapdh-lf-5p:具有如seqidno.19所示的核苷酸序列;和(28)、gapdh-lb-5p:具有如seqidno.20所示的核苷酸序列;和(29)、gapdh-fip-5p:具有如seqidno.21所示的核苷酸序列;和(30)、gapdh-bip-5p:具有如seqidno.22所示的核苷酸序列;或(31)、如(25)~(30)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(25)~(30)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(32)、与(25)~(30)任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列;和/或探针组合三:gapdh基因探针(33)、gapdh-bhq1:具有如seqidno.23所示的核苷酸序列;和(34)、gapdh-hex:具有如seqidno.24所示的核苷酸序列;或(35)、如(33)或(34)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列,且与(33)或(34)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;(36)、与(33)或(34)所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。[0012]在本发明的一些具体实施方案中,所述引物探针组合中,所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个或3个。[0013]本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用;所述病毒包括新型冠状病毒covid-19。[0014]此外,本发明还提供了病毒扩增的rt-lamp试剂,包括如下组分:tris-hcl10mm~20mm(nh4)2so45mm~20mmkcl25mm~100mmtween200.05%~0.5%(v/v,体积百分比)bst聚合酶0.25u/μl~0.5u/μl耐高温逆转录酶1u/μl~5u/μlmg2+6mm~10mm牛磺酸25mm~100mmpeg350000.5%~2%(w/v,质量体积比)本发明还提供了所述的病毒扩增的rt-lamp试剂在制备病毒检测的试剂盒中的应用;所述病毒包括新型冠状病毒covid-19。[0015]更重要的是,本发明还提供了病毒检测的试剂盒,包括所述的病毒核酸提取或保存试剂、所述的引物探针组合和/或所述的病毒扩增的rt-lamp试剂以及可接受的助剂。在本发明的一些具体实施方案中,所述病毒包括新型冠状病毒covid-19。[0016]基于上述研究,本发明还提供了一种病毒检测方法,取待测样本与所述试剂盒中所述的病毒核酸提取或保存试剂、所述的引物探针组合和/或所述的病毒扩增的rt-lamp试剂混合后扩增,检测。[0017]本发明的有益效果包括但不限于:(1)本发明病毒检测装置提供了一种简单易行的病毒核酸提取方法,整个过程大约5-15分钟,回收纯化的核酸,可用于病毒核酸的检测。包括pcr、nasba、lamp、rpa等。相比较于传统的病毒提取方法,本方法病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广。[0018](2)本专利涉及单管同时检测新型冠状病毒covid-19n和orf基因以及人源内参基因的等温扩增引物、探针组合序列和反应缓冲液,该体系特异性好,灵敏度高(50cp/ml),特异性高,只需20min的检测时间,最快可在10min左右报阳性。附图说明[0019]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。[0020]图1示扩增结果;其中,图1a示本发明试剂扩增产物的cas酶切结果;图1b示商业化对比试剂的cas酶切结果;图2示本发明n引物和文献引物扩增效果对比;图3示ic基因为gapdh时的扩增结果;图4示n、orf、gapdh三重扩增的检测结果;图5示实施例15中不同提取试剂提取核酸的检测结果;其中,图5a示实施例3所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图;图5b示实施例4所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图;图6示实施例16中50copies/ml假病毒咽拭子的检测结果。具体实施方式[0021]本发明公开了病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。[0022]本发明的技术方案包括:(1)本发明提供了一种便捷的病毒核酸保存和快速提取试剂,包括组分1为含有oligodt14-20的磁珠。组分2为裂解保存液,其组成为十二烷基锂、tritonx-100、异硫氰酸胍、tris、nacl。组分3为清洗液(可选),其组成为tritonx-100、kcl。组分4为洗脱液(可选),其组成为tris和edta。其中组分2,具有保存病毒和促进病毒颗粒释放核酸与磁珠结合的双重作用,采用偶连有通用性或特异性寡核酸的磁珠对病毒核酸进行捕获,无需清洗(或经简单无醇溶液清洗),即可用于下游的病毒检测生物反应,包括pcr、恒温扩增等检测技术。整个病毒核酸提取纯化过程大约5-15分钟。相比较于传统的病毒提取方法,本方法病毒核酸提取不含有乙醇等清洗步骤、回收率高、用时少、操作方便、适用于自动化核酸提取装置,易于临床推广。[0023](2)病毒核酸保存和快速提取试剂中,组分2具体组成为十二烷基硫酸锂(0.01%-0.05%)、tritonx-100(0.5%-3%)、异硫氰酸胍(0.5-1.5m)、tris(0.01-0.1m)、nacl(0.1m-0.2m)。其中可优选十二烷基硫酸锂(终浓度0.016%)、tritonx-100(终浓度1.64%)、异硫氰酸胍(终浓度1.03m)、trisph=8.0(终浓度0.042m)、nacl(终浓度0.21m)。组分3为清洗液(可选),其组成为tritonx-100(0.05%-0.2%)、kcl(0.05m-0.2m)。其中可优选tritonx-100(终浓度0.1%)、kcl(0.1m)。组分4为洗脱液(可选),其组成为tris(10-100mm)、edta(1-10mm)。可优选tris终浓度100mm、edta终浓度10mm。[0024](3)一组高效、特异性强、灵敏度高的covid-19病毒n基因rt-lamp引物组。具体序列如下:n1-f3ccgcaaattgcacaatttn1-b3cctttttaggctctgttggtgn1-fipgtgtaggtcaaccacgttccccttcagcgttcttcggaatn1-bipagctgccatcaaattggatgacgttttgtatgcgtcaatatgcttn1-lfgtgtgacttccatgccaatgcn1-lbaaatttcaaagatcaagtcattttgc(4)一组高效、特异性强、灵敏度高的covid-19病毒n基因探针。其特点为针由2条oligo退火组成,其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如(tmara、bhq1、bhq2等)。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补,且在oligo2的3’端标记荧光基团如(fam、hex、vic、rox等)。将oligo1和oligo2混合后,退火形成一个双链结构,从而使的荧光基团和淬灭基团靠近,形成淬灭荧光探针。本发明covid-19n基因荧光探针的oligo可如下所示:n-bhq1:5’-bhq1-gtgtaggtcaaccacgttccccttcagcgttcttcggaat-3’2%)。[0028]本发明的有益效果包括但不限于:(1)本发明提供了了一款用于新型冠状病毒covid-19核酸检测的试剂盒,试剂盒包括病毒核酸提取、新型冠状病毒covid-19核酸n基因和orf1ab基因的rt-lamp引物及探针、内参基因扩增引物及探针。本试剂盒全过程均在同一温度下进行,对扩增所需仪器的要求大大简化,试剂成本经济,一次可检测96份样本,适用于高通量新冠病毒核酸检测,从核酸提取到检测结果仅需25~35min,反应时间较pcr大大缩短,检测灵敏度可达50拷贝/ml,具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。[0029](2)本发明提供了一种便捷的病毒核酸保存和快速提取试剂,包括组分1为含有oligodt14-20的磁珠。组分2为裂解保存液,其组成为十二烷基锂、tritonx-100、异硫氰酸胍、tris、nacl。组分3为清洗液(可选),其组成为tritonx-100、kcl。组分4为洗脱液(可选),其组成为eb(tirs和edta)。其中组分2,具有保存病毒和促进病毒颗粒释放核酸与磁珠结合的双重作用,采用偶连有通用性或特异性寡核酸的磁珠对病毒核酸进行捕获,无需清洗(或经简单无醇溶液清洗),即可用于下游的病毒检测生物反应,包括pcr、恒温扩增等检测技术。整个病毒核酸提取纯化过程大约5-15分钟。相比较于传统的病毒提取方法,本方法病毒核酸提取不含有乙醇等清洗步骤、回收率高、用时少、操作方便、适用于自动化核酸提取装置,易于临床推广。[0030](3)本发明涉及一组用于检测新型冠状病毒covid-19核酸和人源内参基因的rt-lamp引物组合及rt-lamp荧光探针。本引物组合比目前文献报道的新冠病毒rt-lamp引物组合灵敏度更高。[0031](4)本发明涉及一种高效病毒扩增的rt-lamp试剂,组分包括tris-hcl(10-20mm)、(nh4)2so4(5-20mm)、kcl(25-100mm)、tween20(0.05-0.5%)、bst聚合酶(0.25-0.5u/μl)、耐高温逆转录酶(1-5u/μl)、mg2+(6-10mm)、牛磺酸(25-100mm)、peg35000(0.5-2%)。[0032]本发明提供的病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用中,所用原料及试剂均可由市场购得。[0033]下面结合实施例,进一步阐述本发明:实施例1:病毒核酸的提取试剂具体组分配置可按照以下组成:组分1为含有oligodt14-20的磁珠。[0034]组分2为裂解保存液,其组成为:十二烷基硫酸锂(终浓度0.016%)、tritonx-100(终浓度1.64%)、异硫氰酸胍(终浓度1.03m)、trisph=8.0(终浓度0.042m)、nacl(终浓度0.21m)。[0035](3)组分3为清洗液,其组成为:tritonx-100(终浓度0.1%)、kcl(0.1m)。[0036](4)组分4为洗脱液,其组成为:tris终浓度100mm、edta终浓度10mm。[0037]实施例2:病毒核酸的提取试剂具体组分配置可按照以下组成:组分1为含有oligodt14-20的磁珠。[0038]组分2为裂解保存液,其组成为:十二烷基硫酸锂(0.01%)、tritonx-100(3%)、异硫氰酸胍(0.5m)、tris(0.1m)、nacl(0.1m)。[0039](3)组分3为清洗液,其组成为tritonx-100(0.05%)、kcl(0.2m)。[0040](4)组分4为洗脱液,其组成为tris(10mm)、edta(10mm)。[0041]实施例3:病毒核酸的提取试剂具体组分配置可按照以下组成:组分1为含有oligodt14-20的磁珠。[0042]组分2为裂解保存液,其组成为十二烷基硫酸锂(0.05%)、tritonx-100(0.5%)、异硫氰酸胍(1.5m)、tris(0.01)、nacl(0.2m)。[0043](3)组分3为清洗液,其组成为tritonx-100(0.2%)、kcl(0.05m)。[0044](4)组分4为洗脱液,其组成为tris(100mm)、edta(1mm)。[0045]实施例4:病毒核酸的提取试剂具体组分配置可按照以下组成:组分1为含有oligodt14-20的磁珠。[0046]组分2为裂解保存液,十二烷基硫酸锂(终浓度0.016%)、tritonx-100(终浓度1.64%)、异硫氰酸胍(终浓度1.03m)、trisph=8.0(终浓度0.042m)、nacl(终浓度0.21m)。[0047]实施例5:病毒核酸的提取试剂的制备分别按照实施例1~4的配方,制备病毒核酸的提取试剂,步骤如下:(1)捕获磁珠从4℃冰箱取出后,室温放置30min后使用。[0048](2)取478μl裂解结合液,加入12μl捕获磁珠和400μl咽拭子保存液,室温孵育4-10min。[0049](3)磁力磁吸1-2min,弃上清。磁珠可直接用于下游反应。[0050](4)也可于磁力架上继续加入600μl漂洗液后,弃掉上清。加入30μlelutionbuffer重悬磁珠,65℃孵育1-3min洗脱病毒rna。[0051]实施例6:covid-19rt-lamp引物及探针的设计(1)covid-19n基因rt-lamp引物根据covid-19的n基因序列设计rt-lamp的引物组合,本引物组合包括6条引物。具体引物信息如下:表1n1-f3seqidno.1ccgcaaattgcacaatttn1-b3seqidno.2cctttttaggctctgttggtgn1-fipseqidno.3gtgtaggtcaaccacgttccccttcagcgttcttcggaatn1-bipseqidno.4agctgccatcaaattggatgacgttttgtatgcgtcaatatgcttn1-lfseqidno.5gtgtgacttccatgccaatgcn1-lbseqidno.6aaatttcaaagatcaagtcattttgc(2)covid-19n基因探针设计covid-19n基因探针由2条oligo退火组成,其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如(tmara、bhq1、bhq2等)。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补,且在oligo2的3’端标记荧光基团如(fam、hex、vic、rox等)。将oligo1和oligo2混合后,退火形成一个双链结构,从而使的荧光基团和淬灭基团靠近,形成淬灭荧光探针。[0052]本发明covid-19n基因荧光探针的oligo可如下所示:n-bhq1:5’-bhq1-gtgtaggtcaaccacgttccccttcagcgttcttcggaat-3’(如seqidno.7所示)n-rox:5’-ggaacgtggttgacctacac-rox-3’(如seqidno.8所示)将n-bhq1和n-rox混合后退火,即为n基因探针,标记为ba_n_probe。[0053](3)covid-19orf基因rt-lamp引物根据covid-19的orf基因序列设计rt-lamp的引物组合,本引物组合包括6条引物。具体引物信息如下:表219cov-orf-1-f3seqidno.9atcgtgttgtctgtactg19cov-orf-1-b3seqidno.10gttcgcggagttgatcaca19cov-orf-1-fipseqidno.11caagttgtaggtatttgtacatacgttgccacatagatcatccaaat19cov-orf-1-bipseqidno.12gaccctgtgggttttacacttaatacagccataacctttccacata19cov-orf-1-lfseqidno.13agtcacaaaatcctttag19cov-orf-1-lbseqidno.14acagtctgtaccgtctgc(4)covid-19orf基因rt-lamp探针设计covid-19orf基因探针由2条oligo退火组成,其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如(tmara、bhq1、bhq2等)。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补,且在oligo2的3’端标记荧光基团如(fam、hex、vic、rox等)。将oligo1和oligo2混合后,退火形成一个双链结构,从而使的荧光基团和淬灭基团靠近,形成淬灭荧光探针。[0054]本发明covid-19orf基因荧光探针的oligo可如下所示:orf-bhq1:5’-bhq1-ꢀgaccctgtgggttttacacttaatacagccataacctttccacata-3’(如seqidno.15所示)orf-fam:5’-ttaagtgtaaaacccacagggtc-fam-3’(如seqidno.16)将orf-bhq1和orf-fam混合后退火,即为n基因探针,标记为ba_orf_probe。[0055]实施例7:ic基因的选择、ic基因的rt-lamp引物及探针设计(1)内参基因gapdh的rt-lamp引物以人基因gapdh序列为参考,设计内参基因gapdh基因rt-lamp引物组合,该引物组合包括6条oligo。具体如下所示:表3gapdh-f3-5pseqidno.17ggactcatgaccacagtccagapdh-b3-5pseqidno.18gcttcccgttcagctcaggapdh-lf-5pseqidno.19ggaggggccatccacagtcgapdh-lb-5pseqidno.20gcctctactggcgctgcgapdh-fip-5pseqidno.21cggccatcacgccacagtttccatcactgccacccagagapdh-bip-5pseqidno.22ggggctctccagaacatcatccgatgaccttgcccacagc(2)内参基因gapdh基因探针gapdh基因探针由2条oligo退火组成,其中1条oligo1的序列在oligo的5’端标记一个荧光淬灭基团如(tmara、bhq1、bhq2等)。另外一条oligo2的序列与oligo1的5端序列部分序列反向互补,且在oligo2的3’端标记荧光基团如(fam、hex、vic、rox等)。将oligo1和oligo2等量混合后,退火形成一个双链结构,从而使的荧光基团和淬灭基团靠近,形成淬灭荧光探针。本发明中的一个实施例中,gapdh基因探针序列如下:gapdh-bhq1:5’-bhq1-ggggctctccagaacatcatccgatgaccttgcccacagc-3’(如seqidno.23所示)gapdh-hex:5’-gatgatgttctggagagcccc-hex-3’(如seqidno.24所示)将gapdh-bhq1和gapdh-hex混合后退火,即为gapdh基因探针,标记为gapdh_probe。[0056]实施例8:rt-lamp扩增试剂本发明涉及一种高效病毒扩增的rt-lamp试剂,组分包括tris-hcl(10-20mm)、(nh4)2so4(5-20mm)、kcl(25-100mm)、tween20(0.05-0.5%)、bst聚合酶(0.25-0.5u/μl)、耐高温逆转录酶(1-5u/μl)、mg2+(8mm)、牛磺酸(50mm)、peg35000(1%)。其中bst聚合酶可为bst4.0dna/rnapolymerase、bst1.0或bst2.0,逆转录酶可为thermostablevreversetranscriptase、hifair®ꢀⅲꢀreversetranscriptase第三代耐热逆转录酶、superscriptiv逆转录酶。[0057]实施例9:rt-lamp扩增试剂本发明涉及一种高效病毒扩增的rt-lamp试剂,组分包括tris-hcl(10-20mm)、(nh4)2so4(5-20mm)、kcl(25-100mm)、tween20(0.05-0.5%)、bst聚合酶(0.25-0.5u/μl)、耐高温逆转录酶(1-5u/μl)、mg2+(6mm)、牛磺酸(25mm)、peg35000(0.5%)。其中bst聚合酶可为bst4.0dna/rnapolymerase、bst1.0或bst2.0,逆转录酶可为thermostablevreversetranscriptase、hifair®ꢀⅲꢀreversetranscriptase第三代耐热逆转录酶、superscriptiv逆转录酶。[0058]实施例10:rt-lamp扩增试剂本发明涉及一种高效病毒扩增的rt-lamp试剂,组分包括tris-hcl(10-20mm)、(nh4)2so4(5-20mm)、kcl(25-100mm)、tween20(0.05-0.5%)、bst聚合酶(0.25-0.5u/μl)、耐高温逆转录酶(1-5u/μl)、mg2+(10mm)、牛磺酸(100mm)、peg35000(2%)。其中bst聚合酶可为bst4.0dna/rnapolymerase、bst1.0或bst2.0,逆转录酶可为thermostablevreversetranscriptase、hifair®ꢀⅲꢀreversetranscriptase第三代耐热逆转录酶、superscriptiv逆转录酶。[0059]实施例11:本发明rt-lamp扩增试剂与商业化扩增试剂扩增效果比较按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子涮洗液的病毒核酸或者不含假病毒的咽拭子涮洗液阴性对照核酸样品,分别采用上述实施例8提供的本发明rt-lamp扩增试剂和商业化扩增试剂,65℃,25min扩增,分别测试7个阳性样品。[0060](1)本发明体系配置如下:成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001%mg2so48mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmsample20μlh2o补充到40μl100μm的ba_n-primer为100μm的n1-f3、n1-b3、n1-fip、n1-bip、n1-lf、n1-lb等引物按照比例4:4:16:16:8:8进行混合。[0061](2)对比商业化扩增试剂(bst2.0dnapolymerase,neb货号:m0275)。按其说明书配置。具体如下:成份40µl体积10×isothermalbuffer1×dntp(25mmeach)1.4mmbst2.0dnapolymerase12.8uwarmstarrtx0.8mg2so48mmba_n-primer5μmsample20μlh2o补充到40μl100μm的ba_n-primer为100μm的n1-f3、n1-b3、n1-fip、n1-bip、n1-lf、n1-lb等引物按照比例4:4:16:16:8:8进行混合。[0062](3)扩增完成后,采用cas12a酶切体系,对扩增结果进行确认和检测。engenlbacas12a(cpf1)购自neb(m0653s)。cas酶切体系如下:总体系体系(10μl)h2o6.93nebbuffer2.10.88engenlbacas12a(1μm)0.44grna(1μm)0.55reporter(20μm)0.22lamp产物1(4)试验结果图1a、图1b显示:使用商业化扩增试剂7个样品中仅有3个有扩增产物检出,而本发明所述扩增试剂7个样品全有扩增产物检出。[0063]实施例12:本发明专利covid-19n基因rt-lamp引物与文献rt-lamp引物对比(1)参考文献所发表covid-19n基因rt-lamp引物组,具体序列如下:表4wx_n-f35’-aacacaagctttcggcag-3’wx_n-b35’-gaaatttggatctttgtcatcc-3’wx_n-fip5’-tgcggccaatgtttgtaatcagccaaggaaattttggggac-3’wx_n-bip5’-cgcattggcatggaagtcactttgatggcacctgtgtag-3’wx_n-lf5’-ttccttgtctgattagttc-3’wx_n-lb5’-accttcgggaacgtggtt-3’将上述covid-19n基因rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,按照4:4:16:16:8:8进行混合,标记为wx_n-primer(100μm)。[0064]同时,根据文献发表的covid-19n基因rt-lamp引物序列,设计合成探针。[0065]表5wx_n_bip_bhq25’-bhq2-cgcattggcatggaagtcactttgatggcacctgtgtagwx_n_bd_roxaagtgacttccatgccaatgcg-rox3’将wx_n_bip_bhq2和wx_n_bd_rox混合后退火,标记为wx_n_probe。[0066](2)本发明实施例6中所述covid-19n基因rt-lamp引物组和文献报道的rt-lamp引物组比较,按照实施例1所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子,同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和ebbuffer作为对照。[0067](3)本发明所述rt-lamp引物及探针按照以下体系配置rt-lamp反应。成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001.0%mg2so48mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmba_n_probe0.15μmsample20μlh2o补充到40μl[0068](4)文献所述rt-lamp引物及探针按照以下体系配置rt-lamp反应。成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001.0%mg2so48mm牛磺酸50mmwx_n-primer5μmwx_n_probe0.15μmsample20μlh2o补充到40μl[0069]实验结果:实验结果(图2)显示本发明所述n引物比文献所述的引物的出峰时间早,扩增效果好。本发明所述rt-almp引物优于文献所述rt-almp引物。[0070]实施例13:以gapdh为ic内参基因的covid-19n基因的rt-lamp检测试剂实验(1)按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子,同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。[0071]按照实施例8所述的rt-lamp试剂配置体系,gapdh、covid-19n基因的rt-lamp引物及探针序列见实施例6和实施例7。[0072]将上述实施例6的covid-19n基因rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,n1-f3、n1-b3、n1-fip、n1-bip、n1-lf、n1-lb按照4:4:16:16:8:8进行混合,标记为ba_n-primer。[0073]将上述实施例7的rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,将gapdh-f3-5p、gapdh-b3-5p、gapdh-lf-5p、gapdh-lb-5p、gapdh-fip-5p、gapdh-bip-5p按照2:2:16:16:8:8进行混合,标记为gapdh-primer。[0074]按照以下体系配置rt-lamp反应体系如下:成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001.0%mg2so48mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmba_n_probe0.15μmgapdh-primer1.25μmgapdh_probe0.075μmsample20μlh2o补充到40μl(2)将假病毒样品,nc样品和depc水经过实施例1的核酸提取试剂进行提取后。置于荧光定量pcr仪,65℃,反应25min。[0075]实验结果(图3)显示:针对含有100copies/ml假病毒的咽拭子,本发明提供的试剂可以完全检出,阳性检出时间可缩短到30min以内。[0076]实施例14:基于本发明扩增试剂新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒本试剂盒可针对covid-19n基因、covid-19orf基因进行检测,同时以的gapdh为内参基因。具体配制方法如下:高效病毒扩增的rt-lamp试剂,组分包括tris-hcl(10-20mm)、(nh4)2so4(5-20mm)、kcl(25-100mm)、tween20(0.05-0.5%)、bst聚合酶(0.25-0.5u/μl)、耐高温逆转录酶(1-5u/μl)、mg2+(6-10mm)、牛磺酸(25-100mm)、peg35000(0.5-2%)。其中bst聚合酶为bst4.0dna/rnapolymerase(哈尔滨新海基因检测有限公司,货号a3805b),逆转录酶为thermostablevreversetranscriptase(哈尔滨新海基因检测有限公司,货号d0302b),mg2+终浓度优选8mm、牛磺酸终浓度优选50mm,peg35000终浓度优选1%。[0077]按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子,同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。[0078]按照实施例8所述的rt-lamp试剂配置体系,gapdh、covid-19n基因、covid-19orf基因的rt-lamp引物及探针序列见实施例6和实施例7。[0079]将上述实施例6的covid-19n基因rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,n1-f3、n1-b3、n1-fip、n1-bip、n1-lf、n1-lb按照4:4:16:16:8:8进行混合,标记为ba_n-primer。[0080]将上述实施例6的covid-19orf基因rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,将19cov-orf-1-f3、19cov-orf-1-b3、19cov-orf-1-fip、19cov-orf-1-bip、19cov-orf-1-lf、19cov-orf-1-lb按照4:4:16:16:8:8进行混合,标记为ba_orf-primer。[0081]将上述实施例7的rt-lamp引物组分别采用depc-h2o配置成100μm的储存液,将gapdh-f3-5p、gapdh-b3-5p、gapdh-lf-5p、gapdh-lb-5p、gapdh-fip-5p、gapdh-bip-5p按照2:2:16:16:8:8进行混合,标记为gapdh-primer。[0082]按照实施例1提供的提取试剂以及实施例5所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子涮洗液的病毒核酸或者不含假病毒的咽拭子涮洗液阴性对照核酸样品,采用上述本发明rt-lamp扩增试剂,65℃,25min扩增,测试7个阳性样品,7个阴性样品和2个ebbuffer作为对照。具体体系配置如下:成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001%mg2so48mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmba_n_probe0.15μmba_orf-primer5μmba_orf_probe0.15μmgapdh-primer1.25μmgapdh_probe0.075μmsample20μlh2o补充到40μl实验结果:实验结果显示本发明扩增试剂及所述n引物、orf引物、gapdh引物,针对提取的7个100copies/ml假病毒咽拭子样品、7个nc样品及2个ebbuffer均能正确检测,具体如图4所示。[0083]实施例15:不同配比提取试剂提取假病毒后的检测结果按照实施例3和实施例4提供的提取试剂,按照实施例5所述提取方法提取的100copies/ml的假病毒咽拭子,同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子和水作为对照。[0084]按照实施例9所述的rt-lamp体系和实施例14所述的引物及探针体系配置rt-lamp反应体系。65℃,25min扩增。具体体系配置如下:成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001%mg2so46mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmba_n_probe0.15μmba_orf-primer5μmba_orf_probe0.15μmgapdh-primer1.25μmgapdh_probe0.075μmsample20μlh2o补充到40μl实验结果:实施例3所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图(图5a)和实施例4所述提取试剂提取核酸后的扩增结果图(图5b),结果显示实施例3所述提取试剂和实施例4提取的100copies/ml假病毒咽拭子样品、nc样品及ebbuffer样品均能正确检测。[0085]实施例16:50copies/ml假病毒咽拭子的检测结果按照实施例2提供的提取试剂,按照实施例5所述提取方法提取的50copies/ml的假病毒咽拭子,同时提取没有掺入假病毒的空白咽拭子作为对照。补充水。[0086]按照实施例10所述的rt-lamp体系和实施例14所述的引物及探针体系配置rt-lamp反应体系。65℃,25min扩增。具体体系配置如下:成份终浓度tris-hcl(ph8.8)20mm(nh4)2so410mmkcl50mmtween200.1%dntp(25mmeach)1.4mmbst4.014.4uthermostablevrtase80upeg350001%mg2so46mm牛磺酸50mmba_n-primer5μmba_n_probe0.15μmba_orf-primer5μmba_orf_probe0.15μmgapdh-primer1.25μmgapdh_probe0.075μmsample20μlh2o补充到40μl实验结果:50copies/ml假病毒提取核酸后的扩增结果图(图6),n基因、orf基因和gapdh基因,50copies/ml假病毒咽拭子样品及nc样品均能正确检测。[0087]以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本
技术领域:
:的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3 

起点商标作为专业知识产权交易平台,可以帮助大家解决很多问题,如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通,为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除

tips