控制糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法与流程

[0001]
本发明涉及调控糖蛋白组合物中去岩藻糖基化种类比例的方法，还涉及通过本发明方法获得的组合物。背景
[0002]
在蛋白质表达期间，其通常会经历翻译后修饰，这些修饰包括糖部分的附连。此类糖基化对于蛋白质的生物学活性可具有深远的影响。例如，抗体依赖性细胞毒性(adcc)是许多治疗性抗体的重要作用机理，该毒性依赖于抗体的岩藻糖基化水平。
[0003]
具体而言，已发现岩藻糖基化量降低的单克隆抗体相较于其岩藻糖基化的对应抗体而言具有更高的adcc。
[0004]
需要控制糖蛋白组合物中的翻译后修饰，例如控制去岩藻糖基化水平。


技术实现要素：

[0005]
本发明人已发现通过改变温度和/或ph能够受控地调控蛋白质去岩藻糖基化水平。
[0006]
具体而言，本公开涉及如下内容：1.根据(a)或(b)控制糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法：(a)一种相较于糖蛋白组合物的参比去岩藻糖基化水平提高该糖蛋白组合物的去岩藻糖基化水平的方法，其中，所述方法包括：在一定温度和/或ph下培养表达糖蛋白的真核细胞，所述温度和/或ph低于培养表达其去岩藻糖基化水平为参比去岩藻糖基化水平的糖蛋白的所述细胞所用的ph和/或温度；或者(b)一种相较于糖蛋白组合物的参比去岩藻糖基化水平降低该糖蛋白组合物的去岩藻糖基化水平的方法，其中，所述方法包括：在一定温度和/或ph下培养表达糖蛋白的真核细胞，所述温度和/或ph高于培养表达其去岩藻糖基化水平为参比去岩藻糖基化水平的糖蛋白的所述细胞所用的ph和/或温度。2.如项目1所述的方法，其中，仅温度(a)低于或(b)高于培养表达其去岩藻糖基化水平为参比去岩藻糖基化水平的糖蛋白的所述细胞所用的温度。3.如项目1所述的方法，其中，仅ph(a)低于或(b)高于培养表达其去岩藻糖基化水平为参比去岩藻糖基化水平的糖蛋白的所述细胞所用的ph。4.如项目1所述的方法，其中，温度和ph均(a)低于或(b)高于培养表达其去岩藻糖基化水平为参比去岩藻糖基化水平的糖蛋白的所述细胞所用的ph和温度。5.如项目1-4中任一项所述的方法，其中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。6.如项目5所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为cho细胞。7.如项目1-6中任一项所述的方法，其中，所述糖蛋白为抗体或抗体片段。8.如项目1-7中任一项所述的方法，其中，ph和/或温度的变化限于生产阶段。
9.可通过项目1-8中任一项所述的方法获得的糖蛋白组合物。10.一种试剂盒，其包含项目9所述的糖蛋白组合物和使用说明书。
[0007]
就本发明任何具体方面而言的任何特征(包括可选的、适宜的和优选的特征)也可为就本发明其他方面而言的特征(包括可选的、适宜的和优选的特征)。
附图说明
[0008]
图1显示了ph和温度对总去岩藻糖基化聚糖的水平(＝a0+a1+a2+m4+m5+m6+m7+m8)的组合作用。所指示的ph是指用于培养第5天和第17天之间的ph上限。
[0009]
图2显示了ph和温度对总高甘露糖聚糖的水平(＝m4+m5+m6+m7+m8)的组合作用。
[0010]
图3显示了ph和温度对m6糖型(包含6个甘露糖的高甘露糖类型)水平的组合作用。
[0011]
图4显示了获自低去岩藻糖基化过程和高去岩藻糖基化过程的阿达木单抗样品的总去岩藻糖基化聚糖的水平(＝a0+a1+a2+m4+m5+m6+m7+m8)和总高甘露糖聚糖的水平(＝m4+m5+m6+m7+m8)。
[0012]
图5显示了获自低去岩藻糖基化过程和高去岩藻糖基化过程的阿达木单抗样品的总半乳糖基化聚糖的水平(＝“fa2g1-1”+”fa2g1-2”+fa2g2+”hybrid-f”)和总g0水平。
[0013]
图6显示获自低去岩藻糖基化过程和高去岩藻糖基化过程的阿达木单抗样品的电荷变体分布。
[0014]
图7显示获自低去岩藻糖基化过程和高去岩藻糖基化过程的阿达木单抗样品的去岩藻糖基化聚糖的水平。发明具体实施方式
[0015]
本发明的一些实施方式中涉及控制糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法，以及根据该方法获得的糖蛋白组合物。
[0016]
在对本发明的至少一个实施方式进行详细解释之前，应理解本发明的应用并不必受限于以下描述中的细节或实施例中的示例。本发明可以具有其它实施方式或以各种方式予以实施和执行。
[0017]
为了控制糖蛋白组合物的去岩藻糖基化水平，本发明人以各种方式深入研究了糖蛋白生产过程的操作，包括在细胞培养过程中加入培养基进料和参数调节。绝大部分测试的参数对去岩藻糖基化水平没有影响。然而，本发明人观察到去岩藻糖基化水平与表达糖蛋白的细胞培养物ph或温度之间的相关性。具体而言，发现了对这两个参数中任一个的操控均与去岩藻糖基化水平的变化相关，并且与单独操控这两个参数之一相比，组合调节这两个参数可进一步提高去岩藻糖基化水平的变化。不限于理论，据信温度和ph对去岩藻糖基化水平的作用至少部分有赖于高尔基体的应激(stress)，并由此不受限于所表达的具体糖蛋白以及用于表达该糖蛋白的具体细胞。
[0018]
因此，本发明涉及通过调节表达糖蛋白的细胞培养物的温度和/或ph来控制糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法。优选地，同时改变ph和温度。
[0019]
本文中提供了一种通过降低表达糖蛋白的细胞培养物的ph和/或温度来提高糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法。本文中还提供了一种通过提高表达糖蛋白的细胞培养物的ph和/或温度来降低糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法。在一些实施方式中，与表达其去岩藻糖基化水平作为参比值的糖蛋白的细胞培养物的ph和/或温度相比，降低或提
高ph和/或温度。
[0020]
提供了一种控制糖蛋白组合物的去岩藻糖基化水平的方法，所述方法包括培养表达所述糖蛋白的细胞，并调整该细胞培养物的温度和/或ph以匹配所需糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平。
[0021]
提供了控制糖蛋白组合物去岩藻糖基化水平的方法，其包括如下步骤：(a)将通过在起始温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞获得的糖蛋白组合物的去岩藻糖基化水平与所需去岩藻糖基化水平比较；(b)确定通过在起始温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞获得的去岩藻糖基化水平是否低于或高于所需去岩藻糖基化水平；以及(c)(i)如果通过在起始温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞获得的去岩藻糖基化水平低于所需去岩藻糖基化水平，则在低于所述起始温度和/或ph的温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞；或者(i)如果通过在起始温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞获得的去岩藻糖基化水平高于所需去岩藻糖基化水平，则在高于所述起始温度和/或ph的温度和/或ph下培养表达所述糖蛋白的细胞。
[0022]
在本发明的方法中，为了选择用于培养细胞的温度和ph，考虑了公知标准，例如细胞活力和蛋白质产量。培养过程通常分为生长和生产阶段。在生长阶段选择促进细胞指数生长的条件，而在生产阶段则选择促进蛋白质生产的条件。
[0023]
除了用于选择温度和ph的公知标准，在本发明培养过程的温度和/或ph选择中还进一步考虑了糖蛋白组合物的所需去岩藻糖基化水平。如前所述，如果需要较高的去岩藻糖基化水平，则可选择较低的ph和/或温度；如果需要较低的去岩藻糖基化水平，则可选择较高的ph和/或温度。
[0024]
根据所需去岩藻糖基化水平调整温度和/或ph可延及整个培养过程，或可限于该过程的一部分，例如限于生产阶段。还可多次调整ph和/或温度。例如，在细胞生长阶段期间采用起始温度和ph后，可在生产阶段开始时将ph和/或温度调整为一定值，并可在生产阶段期间稍后将其调整为其他值。ph和/或温度的调整还可被动和/或逐步进行，例如在细胞生长期间的ph自然降低。
[0025]
本发明方法中的ph和/或温度选择可与常规用于细胞培养的ph和/或温度相同。
[0026]
还提供了生产糖蛋白的方法，其中，在低温和/或低ph下培养生产该糖蛋白的细胞。根据该方法生产的糖蛋白组合物具有特别高的去岩藻糖基化水平。
[0027]
在一个实施方式中，在至少部分培养过程中，例如在至少部分生产阶段中，温度范围为28-34℃。在至少部分生产阶段中的优选温度范围为28-30℃，更优选约29℃。在其他实施方式中，生产阶段中的温度先在至少一天中为32-34℃范围，优选约33℃，然后在至少另一天中为28-30℃范围，优选约29℃。
[0028]
在一个实施方式中，在至少部分培养过程中，例如在至少部分生产阶段中，ph范围为6.6-6.9。在至少部分生产阶段中，优选整个生产阶段中，ph范围优选为ph 6.65-6.8，更优选约ph 6.7-6.75。
[0029]
在一个实施方式中，在至少部分生产阶段中，温度范围为28-34℃且ph范围为ph 6.6-6.9。在至少部分生产阶段中，优选整个生产阶段中，温度优选为28-30℃范围，更优选
约29℃，且ph范围优选为ph 6.65-6.8，更优选约ph 6.7-6.75。在一些实施方式中，生产阶段中的温度范围先在至少一天中为32-34℃，优选约33℃，然后在至少另一天中为28-30℃，优选约29℃，并且整个生产阶段中的ph约为ph 6.7-6.75。
[0030]
用于本发明方法的细胞为真核细胞，优选具有高尔基体的真核细胞。细胞优选为哺乳动物细胞，具体为哺乳动物细胞系。示例性的细胞系包括cho、hela、cos、ns0、sp0、nih 3t3、ht1080、a549、u2os、hek293、p19、cad、j558l、n2a、so-rb50、y79、hep g2、per.c6、hkb-11、cap、huh-7和l929。所用细胞系更优选为cho细胞系。
[0031]
适于本发明的中国仓鼠卵巢组织衍生的cho细胞或细胞系是从中国仓鼠(灰仓鼠，cricetulus griseus)的卵巢组织建立的细胞系的任何细胞。实例包括诸如以下文件中所描述的cho细胞：journal of experimental medicine,108,945(1958)；proc.nat acad.sci.usa,60,1275(1968)；genetics,55,513(1968)；chromosoma,41,129(1973)；methods in cell science,18,115(1996)；radiation research,148,260(1997)；proc.nat acad.sci.usa,77,4216(1980)；proc.nat acad.sci.,60,1275(1968)；cell,6,121(1975)；molecular cell genetics,附录i,ii(pp.883-900)等。此外，本发明中还可采用：atcc(美国典型培养物保藏中心)中登记的cho-k1(atcc ccl-61)、duxb1 1(atcc ccl-9096)和pro-5(atcc ccl-1781)；cho-s(生命技术公司，目录#1 1619)或通过以各种培养基调整细胞系获得的亚细胞系。
[0032]
在一些实施方式中，宿主细胞是cho-1e5、cho-s、cho/dg44、cho-3f或cho-2.6克隆。
[0033]
在本发明改良的细胞培养条件下表达糖蛋白后，可根据常规方式收集糖蛋白表达细胞以及纯化糖蛋白。
[0034]“糖蛋白”是指用糖部分(sugar moiety)修饰的蛋白质。在一些实施方式中，糖蛋白具有治疗用途。在一些实施方式中，糖蛋白选自下组：抗体、抗体片段、酶、受体、激素、调节因子和生长因子。优选的糖蛋白为抗体。
[0035]“抗体”是一种免疫球蛋白分子，其能够通过该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合例如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等靶标。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，除非另作说明，还包括与完整抗体竞争特异性结合的任何其抗原结合片段或抗体片段、包括抗原结合部分的融合蛋白(例如抗体-药物偶联物)、包括抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型、具有多表位特异性的抗体组合物以及多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
[0036]
抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”包含完整抗体的一部分，其仍能够与抗原结合和/或是完整抗体的可变区。抗原结合片段包括例如：fab、fab'、f(ab')2、fd和fv片段，结构域抗体(dab，例如鲨鱼和骆驼科抗体)，包含互补决定区(cdr)的片段，单链可变片段抗体(scfv)，单链抗体分子，由抗体片段形成的多特异性抗体，大型抗体(maxibodies)，迷你抗体(minibodies)，胞内抗体(intrabodies)，双抗体，三抗体，四抗体，v-nar和双scfv(bis-scfv)，线性抗体(参见例如美国专利5,641,870，实施例2；zapata等(1995)，protein eng.8ho:1057)，和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，所述部分足以赋予多肽特异性抗原结合性质。木瓜蛋白酶消化抗体产生称为“fab”片段的两个相同抗原结合片段和其余的“fc”片段，该名称反映了其容易结晶的能力。fab片段由完整l链和h链的可变区结构域(v
h
)
以及一条重链的第一恒定结构域(c
h
1)构成。每个fab片段就抗原结合而言是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个大f(ab')2片段，该片段大致对应于两个通过二硫键相连的fab片段，它们具有不同的抗原结合活性但仍能够交联抗原。fab
′
片段与fab片段的区别在于在c
h
1结构域羧基末端具有数个额外的残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab
′-
sh在本文中指恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基的fab
′
。f(ab')2抗体片段最初以彼此之间有铰链区半胱氨酸的成对fab'片段形式产生。抗体片段的其它化学偶联也是公知的。
[0037]
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白嵌合分子、免疫球蛋白链或片段。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中形成受者互补决定区(cdr)的残基被形成具有所需特异性、亲和性和性能的非人物种(供者抗体，如小鼠、大鼠或兔)cdr的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人残基所替换。人源化抗体也可包含在受者抗体以及输入的cdr或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，且全部或基本上全部的fr区是人免疫球蛋白共有序列的fr区。优化的人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定区的该部分[jones等，nature,321:522-525(1986)；riechmann等，nature,332:323-329(1988)；以及presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)]。
[0038]
在一些实施方式中，抗体是抑制性抗体。抑制性抗体可抑制该抗体所结合抗原的一种或多种生物学活性。例如，抑制性抗体可下调相应抗原的信号转导，该下调通过抑制该抗原的活性或抑制该抗原的表达实现。在一些实施方式中，所述抗体是中和抗体。中和抗体减少或消除可溶性抗原或活微生物(例如感染物)的某些生物学活性。中和抗体可与针对其抗原的天然配体或受体竞争。在一些实施方式中，抗体是刺激性或活化性抗体。刺激性或活化性抗体可为激动剂抗体，其在结合相应抗原时可活化该抗原的信号转导，从而活化或上调该抗原的活性，或上调该抗体结合的抗原的表达。
[0039]
在一个实施方式中，可将轻链和重链转化入独立的经修饰(相同或不同物种)宿主细胞培养物。在另一实施方式中，可用针对轻链和重链的分开的质粒共转化单个经修饰宿主细胞培养物。在另一实施方式中，可将同时包含用于轻链和重链的两种基因且能够表达这两种基因的单个表达质粒转化入单个经修饰的宿主细胞培养物。
[0040]
当重链和轻链在同一宿主中共表达时，设计分离方案以回收重建的抗体。这可通过常规抗体纯化方案完成，例如通过蛋白a-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
[0041]
抗体可结合抗原，例如癌抗原。癌抗原可选自下组：pd-1、pd-l1、her2、免疫球蛋白εfc受体ii、alk-1、cd20、egf受体、vegf受体、fgf受体、ngf受体、pdgf受体、epcam、cd3、cd4、cd11a、cd19、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd51、cd55、cd80、cd95、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ctla-4、粘蛋白1、粘蛋白16、内皮糖蛋白、间皮素受体、nogo受体、叶酸受体、cxcr4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂gd3和α及β整合素。
[0042]
在本发明细胞中生产的示例性抗体包括但不限于：阿伦单抗(alemtuzumab)、阿特株单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴斯利昔单抗(basiliximab)、西普利单
抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、达昔妥珠单抗(dacetuzumab)、多伏罗单抗(durvalumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依帕妥珠单抗(epratuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英利昔单抗(infliximab)；莫罗单抗-cd3(okt3)、纳武单抗(nivolumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕丽珠单抗(palivizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、厄克利珠单抗(ocrelizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、人m195mab、抗aβ、抗cd4、抗oxldl、曲妥珠单抗-dml、阿波单抗、重组人单抗galol、抗ox40l、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、扎鲁土木单抗(zalutumumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、艾克麦昔单抗(ecromeximab)、mdxoio、4b5、tnx-901和idec-114。
[0043]
术语“岩藻糖基化水平”是指蛋白质组合物中带有岩藻糖修饰的聚糖的比例。同样，“去岩藻糖基化水平”是指蛋白质组合物中不含岩藻糖修饰的聚糖的比例。在一些实施方式中，不含岩藻糖修饰的聚糖的比例可如下计算：a0、a1、a2、m4、m5、m6、m7和m8聚糖之和除以总聚糖。
[0044]
本发明还提供了根据本发明方法获得的糖蛋白组合物。
[0045]
糖蛋白组合物可包括药学上可接受的运载体。“药学上可接受的运载体”包括生理相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣/涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的运载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。
[0046]
本公开的组合物可为多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期的给药模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用于人类被动免疫的那些组合物。优选的给药模式是胃肠外给药(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)。在优选实施方式中，通过静脉内输注或注射来给予组合物。在另一优选实施方式中，通过肌肉内或皮下注射来给予组合物。
[0047]
用于口服给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。除糖蛋白外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
[0048]
可以本领域所知的技术采用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制可注射制剂，例如无菌的可注射水性或油质悬浮剂。无菌注射制剂也可以是配制在无毒的胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂、悬浮剂或乳剂，例如配制在1,3-丁二醇中的溶液剂。可用的可接受载剂和溶剂包括水、林格氏溶液u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，将无菌的非挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种低刺激非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂的制备中还用到脂肪酸，如油酸。
[0049]
可将可注射制剂灭菌，例如通过细菌截留过滤器过滤，或引入能在用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂。
[0050]
为了延长糖蛋白的效果，通常需要通过皮下或肌内注射使得吸收变缓。这可通过用水溶性差的晶体或无定形物质的液体悬浮剂来实现。吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮在油载剂中来实现胃肠外给予糖蛋白的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成糖蛋白的微胶囊基质来制备可注射的贮库形式(depot form)。可根据化合物与聚合物之比以及所用特定聚合物的性质来控制化合物的释放速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可通过将化合物圈留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库型可注射制剂。
[0051]
用于直肠或阴道给予的组合物优选栓剂，其可以通过将本发明化合物与合适的无刺激性赋形剂或运载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在环境温度下为固体而在体温下为液体，由此会在直肠腔或阴道腔内融化并释放出活性化合物。
[0052]
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，混合活性化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂或运载体，如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或a)填料或填充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂、例如琼脂-琼脂(agar-agar)、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐或碳酸钠，e)溶液缓凝剂，例如石蜡，f)吸收加速剂，例如季铵化合物，g)湿润剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸附剂，例如高岭土或膨润土，和i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型中还可含有缓冲剂。
[0053]
相似类型的固体组合物也可作为填充剂用于采用诸如乳糖及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以制备成有包衣或外壳的，如肠溶包衣和药物制剂领域熟知的其它包衣。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某部分或优先在肠道的某部分释放活性成分的组合物，所述释放可任选地以缓释方式进行。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。
[0054]
糖蛋白也可以是伴有一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型可以制备成有包衣或外壳的，如肠溶包衣、控释包衣和药物制剂领域熟知的其它包衣。在这类固体剂型中，可以将糖蛋白与至少一种惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。此类剂形还可如常规实践地包含除惰性稀释剂以外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型中还可含有缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某部分或优先在肠道的某部分释放活性成分的组合物，所述释放可任选地以缓释方式进行。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。
[0055]
用于局部或透皮给予糖蛋白的剂型包括油膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉末、溶液剂、喷剂、吸入剂或贴片。将活性成分在无菌条件下与药学上可接受的运载体和任何可能需要的防腐剂或缓冲剂混合。眼科制剂、耳剂和滴眼剂也在本发明的范围之内。此外，本发明还考虑采用透皮贴剂，透皮贴剂的附加优点包括提供化合物向身体的受控递送。此类剂型可通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备。还可采用吸收促进剂来增加化合物的透皮通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中
来控制速率。
[0056]
通常，将糖蛋白掺入适于给予对象的药物组合物中，其中，所述药物组合物包含该糖蛋白和药学上可结受的运载体。许多情形中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药学上可接受的运载体还可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可延长糖蛋白的保质期或有效性。
[0057]
在制造和储存条件下，治疗组合物通常必须是无菌且稳定的。可将组合物配制成溶液、微乳液、分散剂、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。可将所需量的糖蛋白和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，通过将活性成分加入无菌载剂中来制备分散剂，所述无菌载剂包含基础分散介质和所需的前文所述其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法由预先无菌过滤的溶液形成活性成分与任何其他所需成分的粉末。可以保持溶液的适当流动性，例如采用诸如卵磷脂等包衣，在分散剂的情况下通过维持所需的粒径，还可采用表面活性剂。通过在组合物中包含延迟吸收的物质，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0058]
在其他方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含糖蛋白组合物和包装插页，所述插页包含关于使用或给予该糖蛋白组合物的说明书。
[0059]
在其他方面中，本发明涉及糖蛋白组合物在治疗方法中的应用。
[0060]
应理解，述及“处理”或“治疗”包括预防以及已有病症的症状缓解。对状态、紊乱或病症的“处理”或“治疗”包括：(1)防止或者延迟所述状态、紊乱或病症在人对象中出现，所述人对象可患有或易患所述状态、紊乱或病症但尚未经历或表现出所述状态、紊乱或病症的临床或亚临床症状，(2)抑制所述状态、紊乱或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发生发展或其复发(就维持治疗而言)或其至少一种临床或亚临床症状，或者(3)消解或缓解疾病，即致使所述状态、紊乱或病症或其至少一种临床或亚临床症状发生消退。
[0061]
术语“包含”、“含”、“包括”、“含有”、“具有”及其词形变化形式是指“包括但不限于”。
[0062]
在用“约”修饰以数字限定的参数时，其是指该参数的微小变化。在一些实施方式中，术语“约”允许所限定的参数在该参数的指定数值上下变化多达10％，优选地多达5％。当用先行词“约”来限定参数时，该特定值形成另一方面。
[0063]
在整个本申请中，本发明的各种实施方式可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各数值。例如，应当认为诸如1至6的范围描述已具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各数字。
[0064]
每当在本文中指示数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语在第一指示数字和第二指示数字“之间的范围/范围内”和“从”第一指示数字“到”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字及其之间的所有分数和整数。
[0065]
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包括但不限于：化学、药理、生物、生物化学和药学领域从业者已知的方式、手段、技术和过程
或容易从已知方式、手段、技术和过程开发出的方式、手段、技术和过程。应理解，为清楚起见，在单独实施方式的内容中描述的本发明的一些特征还可以合并在单个实施方式中提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或以适合于本发明的任何其他所述实施方式的方式提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下是不可操作的。
[0066]
上文中所描述且如以下权利要求书所述的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
实施例1
[0067]
将表达阿达木单抗的cho细胞保持在分批补料培养中。在相同条件下培养细胞，除了如下文所述改变温度和ph。
[0068]
自培养开始直至第5天，将温度保持在37℃。自培养第5天直至第7天，将温度保持在33℃，然后将温度保持在27、29、31或33℃直到第17天收获。
[0069]
自培养开始直至培养第5天，将ph保持在ph 6.9至ph 7.2。自第5天直至第17天收获，将ph保持在如下ph范围内：ph 6.55-6.6、ph 6.65-6.7、ph 6.75-6.8、ph 6.85-6.9或ph 7.15-7.2。
[0070]
收获后，纯化阿达木单抗并对各样品中的聚糖进行定量。各样品中的总去岩藻糖基化水平(a0、a1、a2、m4、m5、m6、m7和m8聚糖之和)示于图1中。如该图所反映，随着ph和/或温度降低，去岩藻糖基化增加。
[0071]
各样品中的总高甘露糖水平(m4、m5、m6、m7和m8聚糖之和)示于图2中，m6糖型水平示于图3中。实施例2
[0072]
将表达阿达木单抗的cho细胞保持在分批补料培养中。在相同条件下培养细胞，除了温度和ph如下文所述发生变化。
[0073]
在称为低去岩藻糖基化(af)过程的过程中，自培养开始直至第5天将温度保持在37℃，然后直至第17天收获时将温度保持在33℃。自培养开始直至第5天将ph保持在ph 6.9-7.2的范围内，然后直至第17天收获时将ph保持在ph 6.85-6.9的范围内。
[0074]
在称为高去岩藻糖基化(af)过程的过程中，自培养开始直至第5天将温度保持在37℃，然后直至第7天将温度保持在33℃，最后直至第17天收获时将温度保持在29℃。自培养开始直至第5天将ph保持在ph 6.9-7.2的范围内，然后直至第17天收获时将ph保持在ph 6.7-6.75的范围内。
[0075]
收获后，纯化阿达木单抗，并对各样品中的电荷变体进行定量。如图4至图7中所反映，控制ph和温度可实现对总去岩藻糖基化水平的特异性调节，而不会显著影响其他质量参数，如电荷变体总体分布或其他聚糖种类(例如半乳糖基化聚糖)的水平。

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