一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用与流程

一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用。


背景技术：

[0002]
rna主要作为信使将遗传信息从dna传递到蛋白质。然而，rna具有更加广泛的功能。越来越的证据证实rna可以在转录、转录后和翻译水平上调节基因表达。植物中细胞mrna、小干涉rna（sirna）、微小rna以及病原性病毒和类病毒rna可以通过胞间连丝在细胞之间移动，以及通过韧皮部高速公路扩散到远端组织。其中一些移动的rna充当细胞内和细胞间以及系统性信号，以控制植物的防御，生长和发育。例如，流动的赤霉素不敏感基因（gai）mrna能够调节拟南芥，番茄和南瓜的叶片形态。cmnacp的系统移动会影响南瓜的芽和根尖分生组织的维持。bel5 mrna从叶尖移动到茎尖，促进马铃薯中块茎的形成和发育。移动的atft和atcmrna能够调控拟南芥开花。此外，许多rna还能在不同植物之间或同种植物不同生态型之间嫁接的接穗间移动；在寄生植物与寄主之间双向移动，甚至在植物与真菌之间移动。因此，这类移动的rna具有应对生物或非生物胁迫以及植物的生长发育巨大的潜力。这些新兴的rna生理学前沿科学，需要开发新技术来对植物rna进行可视化。
[0003]
rna可视化可以通过采用分子信号标记（mbs）、rna结合标记蛋白（rblps）以及基于rna适配体等方法实现。分子信号标记（mbs）涉及一种特异性探针，在均质溶液中可与靶rna完美互补。rna结合标记蛋白（rblps），比如ms2，pum-hd，hnrnpa1，λn22，cas9，cas13a等，可以与特定rna序列结合后可用于检测目标rna。与mb及rblp方法检测rna不同，rna适配体-菠菜绿（spinach,也叫24-2或者24-2min）以及它的衍生物spinach2可以将目标rna模拟成绿色荧光蛋白（gfp）一样对rna进行可视化。这些rna适配体结合荧光素分子dfhbi（3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮）后会形成分子内g四联体从而发出绿色荧光。这个技术已经成功应用于大肠杆菌，酵母以及人类细胞的rna直接标记，并且还用于定量细胞内的微小rna。与菠菜绿spinach类似的思路，最近，还开发了一种名为pepper的荧光rna适配体。pepper通过与荧光素（（4-（（（2-羟乙基）（甲基）氨基）-亚苄基）-氰基苯基乙腈）结合在哺乳动物细胞中成像rna。虽然基于菠菜绿rna适配体荧光技术在植物领域引起了足够的重视，但一直未成功。本研究中，我们通过在洋葱表皮细胞中瞬时转入菠菜绿rna，实现了在植物中“rna模仿gfp”，本技术可用于rna的可视化。


技术实现要素：

[0004]
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用。本发明利用洋葱表皮细胞无叶绿体的特点，利用基因枪的高压气体，将包裹有peaq-ht/ksk质粒大量导入到洋葱表皮细胞中。再通过dfhbi染料浸润染色后，即可在激光共聚焦显微镜中观察到绿色荧光。
[0005]
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
植物trna在保护和/或稳定菠菜绿rna适配体（spinach, s）与荧光素分子dfhbi相互作用并实现菠菜绿rna在植物体内可视化的应用。
[0006]
所述的应用，其特征在于所述植物trna为赖氨酸转运rna（lysine transfer rna,k）。
[0007]
一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于包括以下步骤：1）构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna即ksk；2）将ksk亚克隆至peaq-ht载体中，得到peaq-ht/ksk，其核苷酸序列如seq id no.4所示；3）采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，与dfhbi相互作用，在激光共聚焦显微镜下观察。
[0008]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于所述步骤1）具体为：直接合成5
’
端含有age i，3
’
端含有sma i酶切位点序列的ksk片段，克隆赖氨酸转运rna和菠菜绿rna，构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna（ksk），赖氨酸转运rna核苷酸序列（k）如seq id no.1所示，菠菜绿rna核苷酸序列（s）如seq id no.2所示，赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna序列如seq id no.3所示。
[0009]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于所述步骤3）具体为：采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100-200
µ
m dfhbi溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
[0010]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于所述基因枪法具体为：采用qiaprep spin miniprep kit试剂盒，提取peaq-ht/ksk质粒，浓缩后调至终浓度为1
µ
g/
µ
l，制备包裹peaq-ht/ksk质粒的金粉，空气中干燥，再加入30
µ
l无水乙醇，取10
µ
l金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击，所述包裹质粒的金粉制备方法为：称取1.5mg直径为1
µ
m的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50
µ
l的50%甘油悬浮，然后依次加入10
µ
gpeaq-ht/ksk质粒，50
µ
l浓度为2.5m的cacl2溶液，20
µ
l的0.1m的亚精胺，以及250
µ
l的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。
[0011]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于所述高渗培养基包括：含0.8%植物凝胶的1/2 ms固体培养基，ph=5.8，内含46.67g/l山梨醇，46.67g/l甘露醇。
[0012]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法，其特征在于所述dfhbi溶液浓度为：100
µ
m。
[0013]
本发明利用分子信号标记、rna结合标记蛋白以及基于rna适配体等方法，实现了rna在植物活细胞内可视化。赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna（缩写为ksk），一旦转入到无叶绿体的洋葱表皮细胞中，在荧光素分子dfhbi存在下，就可以发出很强的绿色荧光。
附图说明
[0014]
图1为菠菜绿rna在洋葱表皮细胞中发绿色荧光；图2为ksk洋葱表皮细胞rna模拟gfp洋葱细胞放大图。
具体实施方式
[0015]
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0016]
实施例1：构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna，简称ksk克隆赖氨酸转运rna和菠菜绿rna，直接合成5
’
端含有age i，3
’
端含有sma i酶切位点序列的ksk片段，构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna。赖氨酸转运rna核苷酸序列如seq id no.1所示，菠菜绿rna核苷酸序列如seq id no.2所示，赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna序列如seq id no.3所示。
[0017]
实施例2：ksk转入载体将ksk亚克隆至peaq-ht载体中，得到peaq-ht/ksk，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0018]
以含有kk序列的pvx/kk载体做模板，利用以下引物得到pcr扩增kk产物，回收pcr产物并利用nru i及xho i双酶切后，连接到采用相同两个酶酶切后的线性化peaq-ht空载体而得到。
[0019]
（peaq-ht/k-k for 5'-atatcgcgacaatcacagtgttggcttgcaaac-3' 下划线为nru i酶切识别位点；peaq-ht/k-k rev5'-atactcgagttgaccctatgggctgtgttg-3'下划线为xho i酶切识别位点）peaq-ht/ksk载体是直接合成5
’
端含有age i，3
’
端含有sma i酶切位点序列的ksk片段，酶切处理后，连入线性化peaq-ht空载体（age i和sma i双酶切后回收的peaq-ht质粒）而得到。
[0020]
实施例3：洋葱表皮观察到足够强的绿色荧光采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，高渗培养基包括：0.8%植物凝胶的1/2 ms培养基，ph=5.8，46.67g/l内含山梨醇，46.67g/l甘露醇。轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100
µ
m的dfhbi溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
[0021]
基因枪法具体为：采用qiagen公司qiaprep spin miniprep kit试剂盒，提取peaq-ht/ksk质粒，浓缩后调至终浓度为1
µ
g/
µ
l。制备包裹peaq-ht/ksk质粒的金粉，方法为：称取1.5mg直径为1
µ
m的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50
µ
l的50%甘油悬浮，然后依次加入10
µ
gpeaq-ht/ksk，50
µ
l浓度为2.5m的cacl2溶液，20
µ
l的0.1m的亚精胺，以及250
µ
l的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。空气中干燥，再加入30
µ
l无水乙醇，取10
µ
l金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击。
[0022]
dfhbi溶液制备：荧光素分子dfhbi（3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮）购自于美国lucerna
tm
公司。将dfhbi溶解于dmso，制备40mm浓度的母液。用hepes缓冲液（ph为7.5）稀释成2 mm的dfhbi，含有5%的dmso的工作液体。在本研究中rna模拟gfp实验中（rmg），dfhbi终浓度为100
µ
m。
[0023]
实施例4：基于菠菜绿的洋葱表皮细胞rna类似gfp观察为了在植物细胞中瞬时高效表达菠菜绿，我们亚克隆kk和ksk到双元载体peaq-ht载体中，分别命名为peaq-ht/kk，peaq-ht/ksk（图1a）。基因枪法peaq-ht/kk，peaq-ht/ksk以及peaq-ht/gfp质粒攻击至没有叶绿体的洋葱表皮细胞中。gfp作为阳性对照。轰击12小时后，可以观察到gfp蛋白的荧光信号（如图1b、1c）。在dfhbi存在下，与kk对照相比（图1d、1e），可
以看到ksk有很强的绿色荧光（如图1f和1g、图2）。
[0024]
图1中，a为peaq-ht/gfp，kk，ksk载体表达盒示意图；将gfp，kk，ksk克隆至peaq-ht载体的多克隆位点内，箭头表示花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子，竖向垂直线段表示花椰菜花叶病毒转录终止序列，mcs表示多克隆位点，在mcs的两端，分别是豇豆花叶病毒的5
’
及3
’
非翻译区；p19为番茄丛矮病毒rna沉默抑制子。b-c为peaq-ht/gfp阳性对照fitc通道荧光及可见光照片；d-e为peaq-ht/kk阴性对照fitc通道荧光及可见光照片；f-g为peaq-ht/ksk的fitc通道荧光及可见光照片；照片均为基因枪轰击12小时后拍摄，在b-c中，标尺为100μm，e-g中，标尺为50μm。

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