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一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用与流程

2021-02-02 02:02:28|327|起点商标网
一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用与流程
一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物学技术领域,具体涉及一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用。


背景技术:

[0002]
rna主要作为信使将遗传信息从dna传递到蛋白质。然而,rna具有更加广泛的功能。越来越的证据证实rna可以在转录、转录后和翻译水平上调节基因表达。植物中细胞mrna、小干涉rna(sirna)、微小rna以及病原性病毒和类病毒rna可以通过胞间连丝在细胞之间移动,以及通过韧皮部高速公路扩散到远端组织。其中一些移动的rna充当细胞内和细胞间以及系统性信号,以控制植物的防御,生长和发育。例如,流动的赤霉素不敏感基因(gai)mrna能够调节拟南芥,番茄和南瓜的叶片形态。cmnacp的系统移动会影响南瓜的芽和根尖分生组织的维持。bel5 mrna从叶尖移动到茎尖,促进马铃薯中块茎的形成和发育。移动的atft和atcmrna能够调控拟南芥开花。此外,许多rna还能在不同植物之间或同种植物不同生态型之间嫁接的接穗间移动;在寄生植物与寄主之间双向移动,甚至在植物与真菌之间移动。因此,这类移动的rna具有应对生物或非生物胁迫以及植物的生长发育巨大的潜力。这些新兴的rna生理学前沿科学,需要开发新技术来对植物rna进行可视化。
[0003]
rna可视化可以通过采用分子信号标记(mbs)、rna结合标记蛋白(rblps)以及基于rna适配体等方法实现。分子信号标记(mbs)涉及一种特异性探针,在均质溶液中可与靶rna完美互补。rna结合标记蛋白(rblps),比如ms2,pum-hd,hnrnpa1,λn22,cas9,cas13a等,可以与特定rna序列结合后可用于检测目标rna。与mb及rblp方法检测rna不同,rna适配体-菠菜绿(spinach,也叫24-2或者24-2min)以及它的衍生物spinach2可以将目标rna模拟成绿色荧光蛋白(gfp)一样对rna进行可视化。这些rna适配体结合荧光素分子dfhbi(3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮)后会形成分子内g四联体从而发出绿色荧光。这个技术已经成功应用于大肠杆菌,酵母以及人类细胞的rna直接标记,并且还用于定量细胞内的微小rna。与菠菜绿spinach类似的思路,最近,还开发了一种名为pepper的荧光rna适配体。pepper通过与荧光素((4-(((2-羟乙基)(甲基)氨基)-亚苄基)-氰基苯基乙腈)结合在哺乳动物细胞中成像rna。虽然基于菠菜绿rna适配体荧光技术在植物领域引起了足够的重视,但一直未成功。本研究中,我们通过在洋葱表皮细胞中瞬时转入菠菜绿rna,实现了在植物中“rna模仿gfp”,本技术可用于rna的可视化。


技术实现要素:

[0004]
针对上述现有技术中存在的问题,本发明的目的在于设计提供一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用。本发明利用洋葱表皮细胞无叶绿体的特点,利用基因枪的高压气体,将包裹有peaq-ht/ksk质粒大量导入到洋葱表皮细胞中。再通过dfhbi染料浸润染色后,即可在激光共聚焦显微镜中观察到绿色荧光。
[0005]
为了实现上述目的,采用以下技术方案:
植物trna在保护和/或稳定菠菜绿rna适配体(spinach, s)与荧光素分子dfhbi相互作用并实现菠菜绿rna在植物体内可视化的应用。
[0006]
所述的应用,其特征在于所述植物trna为赖氨酸转运rna(lysine transfer rna,k)。
[0007]
一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于包括以下步骤:1)构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna即ksk;2)将ksk亚克隆至peaq-ht载体中,得到peaq-ht/ksk,其核苷酸序列如seq id no.4所示;3)采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中,与dfhbi相互作用,在激光共聚焦显微镜下观察。
[0008]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于所述步骤1)具体为:直接合成5

端含有age i,3

端含有sma i酶切位点序列的ksk片段,克隆赖氨酸转运rna和菠菜绿rna,构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna(ksk),赖氨酸转运rna核苷酸序列(k)如seq id no.1所示,菠菜绿rna核苷酸序列(s)如seq id no.2所示,赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna序列如seq id no.3所示。
[0009]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于所述步骤3)具体为:采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中,将洋葱表皮放置在高渗培养基上,轰击12小时后,将洋葱表皮浸润至100-200
µ
m dfhbi溶液中30min,然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
[0010]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于所述基因枪法具体为:采用qiaprep spin miniprep kit试剂盒,提取peaq-ht/ksk质粒,浓缩后调至终浓度为1
µ
g/
µ
l,制备包裹peaq-ht/ksk质粒的金粉,空气中干燥,再加入30
µ
l无水乙醇,取10
µ
l金粉加至载样膜上,利用基因枪系统进行轰击,所述包裹质粒的金粉制备方法为:称取1.5mg直径为1
µ
m的金粉,用70%乙醇洗涤一次,用100%乙醇洗涤两次,快速离心去上清后,获得洗净的金粉,空气中干燥,加50
µ
l的50%甘油悬浮,然后依次加入10
µ
gpeaq-ht/ksk质粒,50
µ
l浓度为2.5m的cacl2溶液,20
µ
l的0.1m的亚精胺,以及250
µ
l的70%乙醇,每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒,待所有试剂加完后,快速离心,去除上清,沉淀即为包裹质粒的金粉。
[0011]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于所述高渗培养基包括:含0.8%植物凝胶的1/2 ms固体培养基,ph=5.8,内含46.67g/l山梨醇,46.67g/l甘露醇。
[0012]
所述的一种基于菠菜绿rna可视化的方法,其特征在于所述dfhbi溶液浓度为:100
µ
m。
[0013]
本发明利用分子信号标记、rna结合标记蛋白以及基于rna适配体等方法,实现了rna在植物活细胞内可视化。赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna(缩写为ksk),一旦转入到无叶绿体的洋葱表皮细胞中,在荧光素分子dfhbi存在下,就可以发出很强的绿色荧光。
附图说明
[0014]
图1为菠菜绿rna在洋葱表皮细胞中发绿色荧光;图2为ksk洋葱表皮细胞rna模拟gfp洋葱细胞放大图。
具体实施方式
[0015]
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0016]
实施例1:构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna,简称ksk克隆赖氨酸转运rna和菠菜绿rna,直接合成5

端含有age i,3

端含有sma i酶切位点序列的ksk片段,构建赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna。赖氨酸转运rna核苷酸序列如seq id no.1所示,菠菜绿rna核苷酸序列如seq id no.2所示,赖氨酸转运rna-菠菜绿rna-赖氨酸转运rna序列如seq id no.3所示。
[0017]
实施例2:ksk转入载体将ksk亚克隆至peaq-ht载体中,得到peaq-ht/ksk,其核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0018]
以含有kk序列的pvx/kk载体做模板,利用以下引物得到pcr扩增kk产物,回收pcr产物并利用nru i及xho i双酶切后,连接到采用相同两个酶酶切后的线性化peaq-ht空载体而得到。
[0019]
(peaq-ht/k-k for 5'-atatcgcgacaatcacagtgttggcttgcaaac-3' 下划线为nru i酶切识别位点;peaq-ht/k-k rev5'-atactcgagttgaccctatgggctgtgttg-3'下划线为xho i酶切识别位点)peaq-ht/ksk载体是直接合成5

端含有age i,3

端含有sma i酶切位点序列的ksk片段,酶切处理后,连入线性化peaq-ht空载体(age i和sma i双酶切后回收的peaq-ht质粒)而得到。
[0020]
实施例3:洋葱表皮观察到足够强的绿色荧光采用基因枪法将peaq-ht/ksk攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中,将洋葱表皮放置在高渗培养基上,高渗培养基包括:0.8%植物凝胶的1/2 ms培养基,ph=5.8,46.67g/l内含山梨醇,46.67g/l甘露醇。轰击12小时后,将洋葱表皮浸润至100
µ
m的dfhbi溶液中30min,然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
[0021]
基因枪法具体为:采用qiagen公司qiaprep spin miniprep kit试剂盒,提取peaq-ht/ksk质粒,浓缩后调至终浓度为1
µ
g/
µ
l。制备包裹peaq-ht/ksk质粒的金粉,方法为:称取1.5mg直径为1
µ
m的金粉,用70%乙醇洗涤一次,用100%乙醇洗涤两次,快速离心去上清后,获得洗净的金粉,空气中干燥,加50
µ
l的50%甘油悬浮,然后依次加入10
µ
gpeaq-ht/ksk,50
µ
l浓度为2.5m的cacl2溶液,20
µ
l的0.1m的亚精胺,以及250
µ
l的70%乙醇,每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒,待所有试剂加完后,快速离心,去除上清,沉淀即为包裹质粒的金粉。空气中干燥,再加入30
µ
l无水乙醇,取10
µ
l金粉加至载样膜上,利用基因枪系统进行轰击。
[0022]
dfhbi溶液制备:荧光素分子dfhbi(3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮)购自于美国lucerna
tm
公司。将dfhbi溶解于dmso,制备40mm浓度的母液。用hepes缓冲液(ph为7.5)稀释成2 mm的dfhbi,含有5%的dmso的工作液体。在本研究中rna模拟gfp实验中(rmg),dfhbi终浓度为100
µ
m。
[0023]
实施例4:基于菠菜绿的洋葱表皮细胞rna类似gfp观察为了在植物细胞中瞬时高效表达菠菜绿,我们亚克隆kk和ksk到双元载体peaq-ht载体中,分别命名为peaq-ht/kk,peaq-ht/ksk(图1a)。基因枪法peaq-ht/kk,peaq-ht/ksk以及peaq-ht/gfp质粒攻击至没有叶绿体的洋葱表皮细胞中。gfp作为阳性对照。轰击12小时后,可以观察到gfp蛋白的荧光信号(如图1b、1c)。在dfhbi存在下,与kk对照相比(图1d、1e),可
以看到ksk有很强的绿色荧光(如图1f和1g、图2)。
[0024]
图1中,a为peaq-ht/gfp,kk,ksk载体表达盒示意图;将gfp,kk,ksk克隆至peaq-ht载体的多克隆位点内,箭头表示花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子,竖向垂直线段表示花椰菜花叶病毒转录终止序列,mcs表示多克隆位点,在mcs的两端,分别是豇豆花叶病毒的5

及3

非翻译区;p19为番茄丛矮病毒rna沉默抑制子。b-c为peaq-ht/gfp阳性对照fitc通道荧光及可见光照片;d-e为peaq-ht/kk阴性对照fitc通道荧光及可见光照片;f-g为peaq-ht/ksk的fitc通道荧光及可见光照片;照片均为基因枪轰击12小时后拍摄,在b-c中,标尺为100μm,e-g中,标尺为50μm。

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