HI,欢迎来到起点商标网!
24小时服务QQ:2880605093

FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用的制作方法

2021-02-02 00:02:03|201|起点商标网
FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用的制作方法
frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药领域,特别涉及frt细胞株在制备筛选piezo1调节 剂的制剂或试剂盒中的应用。


背景技术:

[0002]
2010年末,patapoutian教授等发现了受机械力刺激并促使钙离子内 流的机械压电通道fam38a和fam38b,并命名为piezo1、piezo2,之后相关 研究快速成为热门,两种通道生理功能也逐渐清晰。机械压电通道piezo在多 种哺乳动物内皮细胞中均有表达,其中piezo1能够接受牵拉或按压的机械刺 激并引发细胞外ca
2+
内流,进而参与一系列非常重要的生理功能。有研究发 现,piezo1在血管及淋巴管发育、血压调控、红细胞体积调控中起到了重要 的作用,抑制piezo1的表达会导致淋巴管发育不良,溶血性贫血。piezo1通 道具有一系列重要的生理作用,因此具有较高的研究价值,piezo1的特异性 调节剂在相关研究中发挥重要的作用。研究表明,虽然yoda1和jedi1,jedi2 可以特异性地激活piezo1通道,但是yoda1作为激活剂激活作用周期长,而 jedi1,jedi2与piezo1结合亲和力较低,需要较高浓度的jedi才能引起激活。 现有的抑制剂gd
3+
和钌红(ruthenium red,rr)均是广谱钙离子通道抑制剂, 缺乏特异性。因此,如何高通量筛选piezo1的特异性调节剂是深入研究piezo1 通道亟待解决的问题。
[0003]
电生理技术是研究离子通道的金标准,可以用于离子通道调节剂的筛选。 但是此方法不仅需要特定的仪器设备,对技术人员也有很高的要求,不适合 用于通量筛选激活剂和抑制剂的方法。也有研究者使用放射性离子和阴离子 敏感的荧光染料以及化学发光的方法筛选激活剂和抑制剂,但是也需要特殊 材料和复杂的技术,且局限性较强,同时,一次实验后还要重新制备样品, 限制了方法的推广和应用。


技术实现要素:

[0004]
有鉴于此,本发明构建了基于钙激活氯离子通道蛋白1(ano1)的piezo1 调节剂高通量筛选模型。
[0005]
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0006]
本发明提供了frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用;所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达;
[0007]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂,细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系;
[0008]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值;
[0009]
其中,所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关;
[0010]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下:
[0011][0012]
0s~1.4s的相对荧光值的平均值;
[0013]
y:2.4s~14.8s与0.6s~13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0014]
钙激活氯离子通道蛋白1(anoctamin-1,ano1)作为一种钙激活氯离子 通道(calcium-activated chloride channel,cacc)能够在ca
2+
的作用下开放并 向胞浆中转运cl-、i-等卤素阴离子,但是细胞内外均含有大量cl-,细胞内cl-会在一定程度影响检测结果,而不同于细胞内丰富的cl-,i-在细胞内外含量 极低,选用i-进行实验具有干扰低易控制的优点。黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,yfp)可在细胞内长久表达,其相对荧光强度高,yfp具 有多种突变体,有遇卤素离子淬灭的特性,不同的突变体对不同的卤素离子 敏感,其中双突变体yfp-h148q/i152l对i-具有极高的亲和力,基于此原理, 本研究通过构建共表达ano1-egfp和yfp-h148q/i152l的fischer大鼠甲状 腺上皮(fischer rat thyroid,frt)细胞,构建可用于研究piezo1通道生理功 能的高通量筛选模型,当piezo1通道被激活时,内流的ca
2+
引起cacc开放, 细胞外的i-内流可以引起yfp-h148q/i152l淬灭。模型模式图如图1。本模型 可反复传代,重复性好,经济,快捷,可以敏感地反应细胞内钙信号的变化, 为piezo1通道激活剂、抑制剂的筛选提供更加优秀的解决方案,以及为其他 ca
2+
通道的调节剂高通量筛选方法的建立提供新的思路。
[0015]
在本发明的一些具体实施方案中,所述frt细胞株的构建方法为:构建 钙激活氯离子通道ano1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体 yfp-h148q/i152l真核表达载体,经脂质体转染、抗生素筛选和稀释,获取 共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞。
[0016]
在本发明的一些具体实施方案中,所述piezo1调节剂包括jedi1,jedi2 或yoda1。
[0017]
本发明提供了frt细胞株在检测细胞内游离钙离子浓度中的应用;所述 frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达;
[0018]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂,细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系;
[0019]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值;
[0020]
其中,所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关;
[0021]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下:
[0022][0023]
0s~1.4s的相对荧光值的平均值;
[0024]
y:2.4s~14.8s与0.6s~13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0025]
本发明提供了frt细胞株在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试 剂盒中的应用;所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达。
[0026]
本发明提供了frt细胞株在制备预防和/或治疗与piezo1通道相关疾病的 药物中的应用;所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达;
[0027]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂,细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系;
(slope)值。加入piezo1调节剂应用荧光淬灭动力学实验检测frt模型细胞 slope值,加入piezo1激活剂,应用荧光淬灭动力学实验检测frt模型细胞 slope值并绘制浓度依赖曲线。再通过fura-2荧光探针检测细胞内的钙信号随 piezo1激活剂浓度的变化,分析细胞内ca
2+
浓度与相对荧光强度之间的关系, 计算模型z

因子及信噪比。
[0053]
rt-pcr、dna测序比对和western印迹结果表明,frt细胞内源性表 达piezo1。ano1和yfp-h148q/i152l表达清晰,位置正确,并且ano1被 激活后模型荧光淬灭,证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性,frt模型 细胞构建成功。frt模型细胞加入ano1激活剂离子霉素和piezo1的3种 激活剂jedi1,jedi2,yoda1荧光均淬灭,加入gd
3+
后再加入yoda1荧光不淬 灭,证实模型可以用于筛选piezo1通道调节剂,frt模型细胞离子霉素的ec
50
为(7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
,yoda1的ec
50
为(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
,jedi1的 ec
50
为(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
,jedi2的ec
50
为(158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
。 fura-2实验结果证明模型能敏感的反应细胞内钙信号变化。模型z

因子为 0.82,信噪比为13.29:1,可用于piezo1通道调节剂高通量筛选。
[0054]
本发明成功构建了能够快速,准确,便捷地筛选piezo1通道激活剂和抑 制剂的高通量筛选模型。
附图说明
[0055]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0056]
图1示cacc法筛选piezo1调节剂原理;其中,a:未加激活剂之前,yfp 双突变体荧光未淬灭;b:加激活剂之后,yfp双突变体荧光淬灭;
[0057]
图2示frt细胞中piezo1mrna表达检测结果图;其中,a:以frt细胞的 cdna为模板,应用piezo1两种特异性引物和管家基因β肌动蛋白进行pcr产物 电泳图;b:piezo1条带的切胶回收产物测序结果在chromas软件上进行分析得 到测序峰图,竖线位置为内含子;c:核苷酸序列在ncbi-blast比对结果图;
[0058]
图3示western blot检测frt细胞中piezo1蛋白表达;
[0059]
图4示倒置荧光显微镜观察稳定转染后蛋白质表达情况;其中,a: ano1-egfp在frt细胞中的表达;b:yfp-h148q/i152l在frt细胞中的表达;
[0060]
图5示加入ionomycin应用荧光淬灭动力学实验检测模型ano1和yfp的生 物学活性;
[0061]
图6示加入piezo1的激活剂和抑制剂应用荧光淬灭动力学实验检测模型筛 选piezo1调节剂的功能,其中,a:向模型中分别加入jedi1(终浓度200μmol
·
l-1), jedi2(终浓度150μmol
·
l-1),yoda1(终浓度20μmol
·
l-1)and gd3++yoda1(终浓 度均为20μmol
·
l-1)荧光淬灭动力学实验结果图;b:统计学分析结果,n=4. **p<0.01;
[0062]
图7示各激活剂的剂量依赖曲线,frt模型细胞离子霉素的ec
50
为 (7.76
±
0.53)μmol
·
l-1
,yoda1的ec
50
为(17.27
±
1.21)μmol
·
l-1
,jedi1的ec
50
为(200.60
±
4.46)μmol
·
l-1
,jedi2的ec
50
为(158.10
±
4.65)μmol
·
l-1

[0063]
图8示模型slope值与细胞内ca
2+
浓度关系分析;其中,a:加入不同浓度 yoda1检测模型slope值;b:加入不同浓度yoda1检测模型细胞内ca
2+
浓度;c: 对a、b直线拟合;
[0064]
图9示z

因子检测结果,模型z

因子为0.82;
[0065]
图10示cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果;其中,a示在细胞内不同 ca
2+
浓度情况下,cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果;b示在细胞内ca
2+
浓度分别为40、50、100、200、400和800nmol/l的情况下,cacc法和荧光探 针法灵敏度比较结果。
具体实施方式
[0066]
本发明公开了frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的, 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行 了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的 方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0067]
本发明首次提出了相对荧光强度变化值/slope值/斜率值的概念:
[0068]
本方法通过动态检测相对荧光强度的变化,并进一步量化相对荧光强度 的变化,
[0069]
每一个荧光强度变化值(也称作slope值/斜率值)对应一个细胞内的ca
2+
浓度,结果显示相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关。
[0070]
具体相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下:
[0071][0072]
0s~1.4s的相对荧光值的平均值。
[0073]
y:2.4s~14.8s与0.6s~13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0074]
如图6a为荧光强度变化情况,图6b为根据图6a荧光强度变化情况量 化结果。
[0075]
通过向frt细胞共转染ano1和yfp-h148q/i152l,本研究构建了可用 于piezo1通道调节剂高通量筛选的frt模型细胞,通过验证结果表明,本研 究建立的frt模型细胞可用于筛选piezo1通道调节剂,信噪比为13.29:1。frt 模型细胞对离子霉素,yoda1,jedi1和jedi2的浓度效应ec
50
分别为 (7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
、(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
、(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
、 (158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
。fura-2荧光探针实验证实,frt模型细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系,且ca
2+
浓度变化与frt模型细胞荧光 淬灭slope呈正相关,由于slope比ca
2+
浓度信号窗口更大,因此frt模型细 胞可以敏感反应细胞内ca
2+
浓度的变化,模型z

因子高达0.82,符合高通量 筛选要求。
[0076]
由于本模型本质上是通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂,在快速,灵敏的同时存在一定的缺陷,以下因素可能会 影响筛选结果:首先考虑到frt细胞可能内源性表达的如瞬时受体电位通道、 酸敏感型离子通道1a、毒蕈碱型乙酰胆碱受体和嘌呤能受体等其他一些能升 高细胞内ca
2+
的g蛋白偶联受体或者通道,它们的激活和抑制都会影响到 piezo1通道调节剂的筛选。其次,一些对荧光信号有干扰作用的化合物也会 严重影响筛选结果。此外一些极性较高,且作用位点于细胞内的化合物,因 其不能进入到细胞内,故很难通过本模型筛选。但是,本模型仅作为piezo1 的初筛模型,上述假阳性结果可以通过后续实验分辨真伪。尽管本模型存在 一些问题,但是本模型快速、简
便、经济和稳定性好的优点,仍可以为筛选 工作带来极大的便利。本团队目前已经筛选300余种中药小分子化合物,尚 未发现高活性的激活剂和抑制剂,下一步拟扩大筛选范围,如从核酸适配体 和天然抗体库中筛选,以期发现高效特异的piezo1调节剂。
[0077]
综上,本模型是高通量筛选piezo1通道调节剂的优秀解决方案。本模型 的成功构建不仅为后续piezo1通道调节剂筛选提供了优秀的解决方案,为 piezo1调节剂的临床应用奠定了基础,同时还为其他钙离子通道调节剂筛选 方法的构建提供新思路。
[0078]
统计学分析:所有实验重复3次,数据结果用表示,采用graphpadprism 8.0进行作图与统计学分析,使用单因素方差分析,配对样本t检验,以 p<0.05为差异有统计学意义。
[0079]
主要试剂和仪器
[0080]
frt细胞由alan s.verkman教授馈赠,本实验室保存;所用引物由生工 公司合成;胎牛血清(fetal calf serum,fbs)(以色列biological industries 公司);f-12培养基,fura-2/am,yoda1、jedi1、jedi2和离子霉素(ionomycin) (均美国sigma公司);转染试剂lipofectamine 3000(美国thermo fisher 公司);trizol,遗传霉素(geneticin,g418)和博来霉素(zeocin)(均美 国invitrogen公司);切胶回收试剂盒(生工公司);逆转录试剂盒、pcr试 剂盒、全蛋白提取试剂盒、bca蛋白测定试剂盒(均全式金公司);兔抗大 鼠piezo1多克隆抗体、兔抗大鼠piezo2多克隆抗体、兔抗大鼠β肌动蛋白单 克隆抗体、山羊抗兔igg(hrp标记)(均英国abcam公司)。
[0081]
fluostar omega全自动多功能酶标仪(德国bmg公司),倒置荧光显 微镜(日本nikon公司),co2培养箱(日本panasonic公司),pcr仪(美 国abi公司),凝胶成像仪(美国bio-rad公司),nanodrop 2000(美国 thermo fisher公司),c6流式细胞仪(美国bd公司)。
[0082]
本发明提供的frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0083]
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0084]
实施例1 rt-pcr检测frt细胞piezo1表达
[0085]
设计大鼠piezo1和piezo2的引物各两对(如表1所示),取生长状态良 好的frt细胞株,按照trizol说明书提取frt细胞总rna,nanodrop2000 测量总rna浓度。使用逆转录试剂盒逆转录合成cdna:将rna模板和试 剂盒成分按照试剂盒说明书推荐的用量混匀,65℃孵育5min后冰浴2min, 再加入其余组分,在pcr仪中25℃孵育10min后42℃孵育30min。使用 nanodrop2000测定合成的cdna的质量。pcr对产物进行扩增,葡聚糖凝胶 电泳对比产物长度是否正确。
[0086]
将电泳后的凝胶放置在紫外灯下,用洁净的手术刀切下待测序的条带,切 胶时尽量切得快速,尽量切去不必要的凝胶。使用电子天平对切下的凝胶进 行称重,并按照凝胶的质量按照切胶回收试剂盒说明书推荐比例加入适量的 溶胶试剂,置于60℃溶胶5min,过柱纯化,得到纯化的pcr产物。回收后 的dna溶液进行核酸测序。测序工作由上海生工公司完成。使用chromas软 件检查测序峰,并用ncbi-blast对比核酸序列与测序结果。
[0087]
实施例2 western印迹检测frt细胞piezo1和piezo2蛋白表达
[0088]
取生长状态良好的frt细胞株,按照全蛋白提取试剂盒提取frt细胞总 蛋白,提取完成后使用nanodrop 2000微量分光光度计在280nm波长下测定 浓度,并计算总蛋白量。加
入20μl 5
×
loadingbuffer,于100℃金属浴15min, 制备好的蛋白样品置于-20℃冰箱保存。
[0089]
将制好的蛋白样品于-20℃冰箱中取出室温放置数分钟后,先低速离心1 min,再置于100℃金属浴15min,后12000r/min离心5min。在电泳槽里加 入1
×
电泳液,加入样品,按照nanodrop 2000测出的总蛋白量进行加样,每 个孔上样20μg总蛋白,恒压80v电泳30min。跑至彩色marker分离开后, 更换电压120v电泳60min,直到蓝色条带跑出胶板底部。根据marker指示 的分子大小切胶,按照胶的大小剪好置于pvdf膜。放置好后置于转膜仪中, 100v持续120min。转好的膜置于5%的脱脂奶粉中进行封闭,于室内摇床上 2h,之后用tbs洗膜。洗膜完成加入piezo1,piezo2和β肌动蛋白的兔抗鼠 抗体作为一抗4℃过夜封闭,回收一抗,继续用pbs洗膜,洗3到4次。再 封闭二抗,二抗为羊抗兔抗体。洗完膜后,显色,成像。一抗和二抗均按照 说明书进行1:1000稀释。
[0090]
实施例3共表达ano1-增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,egfp)与yfp-h148q/i152l的frt模型细胞构建
[0091]
取已转入ano1-egfp/pcdna3.1的大肠杆菌接入50ml 2
×
yt培养基, 37℃过夜培养,按照质粒小提取试剂盒说明书裂解细菌提取质粒。提取完成 后,用nanodrop 2000检测质粒的浓度和纯度,按照lipofectamine 3000试剂 要求,取浓度在500~5000mg
·
l-1
的质粒备用。转染前12h消化frt细胞至 24孔板,保证转染时细胞密度达到70%~90%,按照lipofectamine 3000说明 书在ep管中加入转染试剂、质粒和f-12基本培养液,室温孵育20min。孵 育时用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,pbs)清洗细胞,去除残留 的血清。清洗完成后,每个孔中加入450μl f-12完全培养液。脂质体-质粒混 合溶液孵育完成后,向每个孔逐滴加入50μl混合溶液,摇匀后放入co2培 养箱37℃孵育48h,在荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光,表示 ano1-egfp转染成功,再加入含有博来霉素的筛选培养基进行筛选。筛选2 周后对得到的细胞株进行有限稀释,获取表达量高的克隆株。得到高表达的 克隆后扩大培养细胞。
[0092]
用同样的方法提取yfp-h148q/i152l的质粒并转染稳定表达ano1-egfp 的frt细胞。转染48h后,荧光显微镜下观察细胞表达情况,并加入含有遗 传霉素的筛选培养基进行筛选。筛选2周后对得到的细胞株进行有限稀释, 获取表达量高的克隆株。得到高表达的克隆株后扩大培养细胞。
[0093]
实施例4荧光淬灭动力学实验鉴定转染ano1和yfp-h148q/i152l后 frt模型细胞的生物学功能
[0094]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中,37℃过夜培养。使 用含edta的无钙镁pbs清洗细胞2遍,每个孔加入10μmol
·
l-1
的ano1 激活剂离子霉素50μl。在fluostar omega全自动多功能酶标仪的泵中加入 含有ca
2+
、mg
2+
的nai-pbs,设定泵进样量为150μl,泵加样前由仪器确定 各孔的增益(gain)值,与初始荧光强度。泵加样后仪器每隔0.2s自动计算 一次相对荧光强度(由该时刻荧光强度与gain值和初始荧光强度换算得到), 记录各时刻相对荧光强度变化,原始数据由graphpad prism 8.0绘制模式图, 根据荧光淬灭动力学实验结果确定稳定表达ano1和yfp-h148q/i152l的 frt模型细胞是否具有生物学功能。
[0095]
实施例5荧光淬灭动力学实验检测模型功能
[0096]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中,37℃过夜培养。用 含edta的无钙镁pbs清洗细胞2遍,将待检测的细胞分为6组:空白组 (pbs)、离子霉素(10μmol
·
l-1
)、jedi1(200μmol
·
l-1
)、jedi2(150μmol
·
l-1
)、 yoda1(20μmol
·
l-1
)和gd
3+
+yoda1(均20μmol
·
l-1
)组,每组药物体积均 为50μl。在fluostar omega全自动多功能酶标仪的泵中加入含有ca
2+
和 mg
2+
的nai-pbs,设定泵进样量为150μl,泵加样前由fluostar omega全自 动多功能酶标仪确定各孔的增益(gain)值,泵加样后仪器每隔0.2s自动计 算一次相对荧光强度,记录各组相对荧光强度变化。
[0097]
实施例6绘制模型浓度依赖曲线确定模型功能活性
[0098]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中,37℃过夜培养。待 检测的细胞分为5组:空白组、离子霉素、jedi1、jedi2和yoda1,除空白组 外每组按1000,900,800,700,600,500,400,300,200,100,75,50, 25,10,5,1和0.2μmol
·
l-1
设置浓度梯度,每个浓度重复3次,利用excel 软件对原始数据进行宏计算,求出斜率(slope)值。记录各组slope值使用 graphpad prism 8.0软件绘制模型对不同激活剂的浓度依赖曲线。
[0099]
实施例7 fura-2荧光探针法检测frt模型细胞ca
2+
浓度
[0100]
frt模型细胞消化离心后制成细胞悬液,加入fura-2/am(终浓度为5 μmol
·
l-1
),37℃孵育30min,并轻轻振动。采用无钙镁pbs缓冲液洗涤细 胞1次,以去除细胞外残留的fura-2/am。离心后,加入无钙镁pbs缓冲液 制成细胞悬液。在fluostar omega全自动多功能酶标仪中使用340nm和380 nm双激发源在510nm处记录荧光强度,测定时记录静息时和加入yoda1 (piezo1激活剂)给具体浓度后的340nm/380nm荧光比值,根据荧光比值计 算ca
2+
浓度。
[0101]
实施例8 z

因子评估
[0102]
将一个96孔板的前6列加入yoda1100μmol
·
l-1
作为实验组,同时将96 孔板的后6列加入pbs缓冲液作为对照组,检测slope值并计算z

因子值。 计算公式如下:z

=1-3
×
(|sd
yoda1
|+|sd
pbs
|)/(|mean
yoda1
|-|mean
pbs
|)。式中,sd 为标准差,mean为平均数。
[0103]
效果例1
[0104]
frt细胞中piezo1mrna表达
[0105]
以frt细胞的cdna为模板,应用piezo1两种特异性引物分别扩增出一 条401bp和479bp的条带,管家基因β肌动蛋白在对应的泳道出现260bp条 带,与预期的目的片段大小相符(图2a)。piezo2两种特异性引物均未扩增 出条带。piezo1引物设计如表1。
[0106]
piezo1条带的切胶回收产物测序结果在chromas软件上进行分析,测序峰 图如图2b,测序峰峰型整齐,无重叠峰,竖线位置为内含子。所测核苷酸序 列在ncbi-blast进行比对,与genbank数据库收录的piezo1的基因序列 相似性为100%,如图2c。表明frt细胞内源性表达piezo1mrna。
[0107]
表1引物序列
[0108][0109]
frt细胞中piezo1蛋白表达
[0110]
western印迹结果显示,frt细胞中β肌动蛋白表达清晰,有大小为413ku 的piezo1蛋白表达,符合其理论值(如图3),piezo2蛋白未出现对应条带。 表明frt细胞在蛋白水平上内源性表达piezo1。
[0111]
frt细胞模型的鉴定
[0112]
通过荧光显微镜观察,ano1转染成功,表达清晰(图4a), yfp-h148q/i152清晰表达于胞浆中(图4b)。细胞中加入离子霉素10 μmol
·
l-1
,加入i-后,荧光淬灭;只加入pbs的细胞,加后加入i-后,荧光不 淬灭,细胞具有cacc通道功能,证明ano1-egfp表达于frt模型细胞胞 膜上而非表达于细胞外,frt模型细胞构建成功(图5)。
[0113]
表2图4数据
[0114]
[0115]
[0116][0117]
表3图6a数据
[0118]
[0119]
[0120]
[0121][0122]
表4图6b数据
[0123][0124]
frt模型细胞筛选piezo1调节剂的功能
[0125]
frt模型细胞加入ano1激活剂离子霉素后,荧光淬灭;而加入piezo1 的3种激活剂jedi1,jedi2和yoda1荧光淬灭程度对比加入离子霉素组要更大。 +gd
3+
/yoda1组加入gd
3+
后再加入yoda1的荧光不淬灭(图6a)。+yoda1 组与0空白组(pbs)以及+gd
3+
/yoda1组具有显著性差异(p<0.01)(图6b), 说明frt模型细胞可用于piezo1调节剂的筛选。
[0126]
表5图6数据
[0127]
[0128]
[0129]
[0130][0131]
frt模型细胞检测不同激活剂的浓度效应
[0132]
frt模型细胞离子霉素的ec
50
为(7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
,yoda1的ec
50
为(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
,jedi1的ec
50
为(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
,jedi2 的ec
50
为(158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
(图7)。
[0133]
表6图8a数据
[0134][0135][0136]
表7图8b数据
[0137][0138]
frt模型细胞荧光淬灭slope与细胞内ca
2+
浓度关系
[0139]
随着yoda1浓度的升高,ca
2+
浓度越高,其浓度与yoda浓度呈浓度依赖 关系(r2=0.9939,p<0.05)(图8b),ec
50
为(18.68
±
3.91)μmol
·
l-1
。结合 frt模型细胞荧光淬灭slope对yoda1的浓度效应(图8a),利用graphpadprism 8.0软件做出斜率值与细胞内ca
2+
浓度关系(图8c),frt模型细胞荧 光淬灭slope与细胞内ca
2+
浓度呈正相关,且细胞荧光淬灭slope比细胞内ca
2+
浓度值信号窗口更大。因此利用frt模型细胞检测荧光淬灭slope值可以敏 感地反应细胞内ca
2+
浓度的变化。
[0140]
表8图9b数据
[0141]
[0142][0143]
frt模型细胞评估piezo1调节剂yoda1的z

因子
[0144]
经软件分析得yoda1组的slope值为85.60
±
2.21,缓冲液对照组的slope 值为6.44
±
1.55(图9b),信噪比为13.29:1,计算得frt模型细胞piezo1 调节剂yoda1的z

因子为0.82,大于0.5,表明细胞模型可用于piezo1调节 剂的高通量筛选(图9a)。
[0145]
效果例2荧光探针法和基于cacc检测细胞内钙浓度的检测方法(下面简 称为cacc法)比较
[0146]
表9
[0147][0148]
备注:1234比较结果显示cacc法优于荧光探针法;5比较结果显示荧 光探针法优于cacc法。
[0149]
详细说明如下:价格:invitrogen公司的检测细胞内钙浓度的荧光探针 (fluo4)市场价格为4196.00人民币。
[0150]
cacc法灵敏度高于荧光探针法的原因:
[0151]
(1)细胞内ca
2+
浓度仅仅为nm级别或者μm级别,很少能达到mm级 别,也就是说细胞内ca
2+
浓度的微量性决定了其直接检测的难度;
[0152]
(2)cacc法是通过yfp双突变体的相对荧光信号的变化间接反映细胞 内ca
2+
浓度,yfp双突变体具有极强的碘离子敏感的特性;cacc单个通道在 碘离子依次通过的情况下,每秒钟可转运106个碘离子;而且通过稳定转染, 本细胞模型具有高表达cacc的特性(也就是说每个细胞上表达多个cacc); 此外yfp的荧光信号强(yfp的荧光强度是普通荧光信号如gfp即绿色荧光 蛋白的数倍)。
[0153]
如图10所示,结果表明:在细胞内ca
2+
浓度在40、50、100、200、400 和800nm时cacc法灵敏度均显著优于荧光探针法。
[0154]
综上所述,cacc灵敏度高于荧光探针法。
[0155]
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润 饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台,可以帮助大家解决很多问题,如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19008205409】与客服一对一沟通,为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除

tips