一种削减抗性基因的堆肥方法与流程

本发明属于环保技术领域，具体涉及一种削减抗性基因的堆肥方法。

背景技术：

抗生素抗性基因(以下简称抗性基因)作为一种环境新型污染物，因其对环境安全和人类健康产生严重威胁，广泛引起关注。有机固体废弃物(如污泥，垃圾，禽畜粪便等)是抗性基因在环境中的重要储存库和传播源。堆肥是实现有机固体废弃物无害化、资源化的重要方法，因其过程产生的高温可以削减抗性基因含量，吸引了众多学者研究其削减效果。然而，堆肥过程抗性基因的削减通常会呈现先减少后增加的趋势，堆肥后产物的抗性基因丰度甚至比之前更高，抗性基因在堆肥后期增加的原因可能是堆肥产品在堆肥厂区存放过程中受到含有抗性基因的空气粉尘的污染，导致原本被高温消减的抗性基因又出现反弹。

近期，大量学者研究证实，在空气颗粒物或者粉尘中检测到大量的抗性基因和耐药细菌存在，并且在堆肥厂区附近的空气中丰度明显高于其上下游区域。这是由于堆肥过程会伴随拌混、翻抛、粉碎等物料移动行为，这些行为会导致含有大量抗性基因及微生物的颗粒物气溶胶化悬浮于空气中，并随空气传播，这可能对堆肥处理厂工人及周边居民造成健康风险。目前学者大量研究如何提高堆肥过程对抗性基因的消减效果，然而缺乏有效的方法控制空气源抗性基因对堆肥产品污染的影响。空气颗粒物作为抗性基因的潜在储存库缺乏有效方法应对，而通过空气传播具有抗性水平的细菌可能是引起重要疾病的主要传播途径。因此，亟待研发一种削减抗性基因的堆肥方法。

技术实现要素：

为了克服现有堆肥方法存在堆肥产品容易因空气颗粒物沉降污染导致抗性基因丰度反弹以及堆肥产品中的抗性基因容易以颗粒物为媒介随空气传播威胁堆肥处理厂工人及周边居民健康等不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种削减抗性基因的堆肥方法。

本发明的第二个方面的目的，在于提供上述削减抗性基因的堆肥方法在堆肥处理中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种削减抗性基因的堆肥方法，包括如下步骤：以有机固体废弃物为堆肥原料，采用薄膜覆盖堆体进行堆肥，然后进行曝气供氧以实现微正压。

所述堆肥的过程中不进行翻堆。

所述堆肥的时间优选为15～50天；更优选为25～45天；最优选为35～40天。

微正压是指通过控制曝气速率和曝气时间，使该间隙空间内气体过量，薄膜维持“鼓胀”状态，从而使间隙空间处的氧气能自动往堆体中渗透，使堆料布气均匀，始终处于最佳的发酵状态。

所述堆肥原料的初始含水量优选为50～80％；更优选为60～70％。

所述有机固体废弃物优选为污泥、禽畜粪便，农业废弃物和厨余垃圾中的至少一种；更优选为污泥、禽畜粪便和农业废弃物中的至少一种；更优选为污泥、禽畜粪便中的至少一种与农业废弃物。

所述禽畜粪便为鸡粪、牛粪、猪粪、鸭粪、鹅粪和羊粪中的至少一种。

所述农业废弃物为秸秆、稻壳、麦壳、花生壳、玉米棒和杂草中的至少一种。

所述堆肥的方式优选为条垛式堆肥、槽式堆肥和仓式堆肥中的至少一种；更优选为条垛式堆肥和槽式堆肥中的至少一种。

所述薄膜优选为聚四氟乙烯膜；更优选为聚四氟乙烯复合膜。

所述薄膜优选为有小于2μm微孔的薄膜；更优选为有0.2～1μm微孔的薄膜。

所述聚四氟乙烯复合膜优选由抗紫外线层、防水透气层和承托层中的至少二种构成；更优选由抗紫外线层和承托层中的至少一种与防水透气层构成。

所述抗紫外线层为聚酯纤维材料经防紫外线处理后所得，能够避免堆肥过程中外界辐射对复合覆盖层及堆体的影响，但是不隔绝气体和水分。

所述防水透气层为膨体聚四氟乙烯(eptfe)，该膨体聚四氟乙烯防水透气，具有极其稳定的化学性能和很宽的温度适用范围，其上具有大量的小孔，小孔不允许大分子(如：臭气或生物气溶胶)通过，有气味的物质在内层膜上凝聚并回流至堆体，该层为复合膜的核心层，在隔绝环境因素对堆肥过程影响方面发挥重要作用。

所述承托层为聚酯纤维材料经抗酸碱处理后所得，避免堆肥过程中所产生的酸碱环境对复合膜影响的同时，使复合膜具有一定的空间结构可塑性，不会出现完全贴在堆体表面的情况。

所述薄膜覆盖堆体优选采用固定式结构或可拆卸式结构。

所述曝气供氧优选采用鼓风机；更优选采用罗茨风机。

所述曝气速率优选为10～20m³·t^-1·h^-1；更优选为15～20m³·t^-1·h^-1；最优选为15～16m³·t^-1·h^-1。

所述曝气时间优选为10～14h/天；更优选为11～14h/天；最优选为11～12h/天。

所述鼓风机的进风口优选采用玻璃纤维进行过滤。

所述削减抗性基因的堆肥方法还包括如下步骤：薄膜覆盖堆体进行堆肥前在堆肥内设置热电偶，测量堆肥温度。

本发明的第二个方面，提供上述削减抗性基因的堆肥方法在堆肥处理中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的堆肥方法可以有效促进堆肥抗性基因的削减，尤其对于teta、tetl、teto、tetm、sul1、sul2等常见抗性基因削减效果明显，同时，还能本发明通过采用聚四氟乙烯复合膜避免堆肥产品中的抗性基因以颗粒物为媒介随空气传播，威胁堆肥处理厂工人及周边居民健康。

2、该方法操作简单、易于实施，处理成本低，有利于大规模使用。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种削减抗性基因的堆肥方法

(1)将污泥(含水率80％)和稻壳(含水率10％)以质量比4：1比例混合，混合物料的初始含水率约为60％；将混合物料堆置为条垛式，然后采用固定式结构覆盖表面有0.2μm孔径的聚四氟乙烯膜复合膜(购自宁波登越新材料科技有限公司，包括抗紫外线层、防水透气层和承托层，抗紫外线层为聚酯纤维材料经防紫外线处理后所得，防水透气层为膨体聚四氟乙烯，承托层为聚酯纤维材料经抗酸碱处理后所得)。

(2)堆肥过程中采用罗茨风机(罗茨风机的进风口采用玻璃纤维进行过滤)进行曝气供氧，曝气速率为15m³·t^-1·h^-1，曝气时间为12h/天，采用热电偶测量堆肥温度，堆肥过程中不进行翻堆，堆肥时间为40天。

实施例2一种削减抗性基因的堆肥方法

(1)将鸡粪(含水率80％)和玉米秸秆(含水率15％)以质量比3：1比例混合，混合物料的初始含水率约为60％；将物料堆置于砖混结构发酵槽内，然后采用可拆卸式结构覆盖表面有0.2μm孔径的聚四氟乙烯膜复合膜(购自宁波登越新材料科技有限公司，包括抗紫外线层、防水透气层和承托层，抗紫外线层为聚酯纤维材料经防紫外线处理后所得，防水透气层为膨体聚四氟乙烯，承托层为聚酯纤维材料经抗酸碱处理后所得)。

(2)堆肥过程中采用罗茨风机(罗茨风机的进风口采用玻璃纤维进行过滤)进行曝气供氧，曝气速率为16m³·t^-1·h^-1，曝气时间为11h/天，采用热电偶测量堆肥温度，堆肥过程中不进行翻堆，堆肥时间为35天。

对比例1一种削减抗性基因的堆肥方法

本方法与实施例1一致，区别仅在于：步骤(1)中未覆盖表面有0.2μm孔径的聚四氟乙烯膜复合膜。

对比例2一种削减抗性基因的堆肥方法

本方法与实施例2一致，区别仅在于：步骤(1)中未覆盖表面有0.2μm孔径的聚四氟乙烯膜复合膜。

效果实施例

分别取实施例1～2、对比例1～2中步骤(1)中的混合物料及步骤(2)中堆肥结束后的肥料0.5g，分别用fastdna提取试剂盒提取总dna，以总dna为模板，利用pcr技术扩增抗性基因的dna片段(pcr反应体系如表1所示，引物见表3；反应程序为：95℃预变性10min；35个循环包括95℃变性3s、退火30s(退火温度见表3)、72℃延伸60s；最后72℃终延伸6min)。pcr产物经电泳检测后，将目的片段切胶，用dna纯化回收试剂盒(dp214-03，天根，中国)回收纯化。将目的基因片段连入pmdtm19-t载体，转化至感受态细胞dh-5α。挑取单菌落，37℃过夜培养，送至华大基因测序。测序结果通过ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的blast序列同源性检索比对。用质粒小提试剂盒(dp103-03，天根，中国)提取菌液质粒，提取的质粒通过紫外分光光度计测定浓度，按10倍浓度梯度稀释，以拷贝数为横坐标，ct值为纵坐标绘制标准曲线。然后用罗氏lightcycler96实时荧光定量pcr仪检测抗性基因(teta、tetl、teto，tetm、tetx、sul1、sul2、stra、strb、aaca4、aade、ermt)丰度(反应体系如表2所示，引物见表3；反应程序为：95℃预变性2min；40个循环包括95℃变性15s、退火35s(退火温度见表3)、72℃延伸35s。计算得到抗性基因的丰度(基因拷贝数/克干重)，再计算抗性基因的去除率(公式为(堆肥前混合物料的抗性基因的丰度-堆肥后的肥料中抗性基因的丰度)/堆肥前混合物料的抗性基因))，结果如表4、5所示：采用本发明提供的堆肥方法显著提高了混合物料中抗性基因(teta、tetl、teto，tetm、tetx、sul1、sul2、stra、strb、aaca4、aade、ermt)的去除率，尤其是实施例1中对teta、teto，tetx、sul1、stra、strb、ermt等抗性基因削减效果明显，实施例2中对teta、tetl、teto，tetm、tetx、sul1、aade等抗性基因削减效果明显。

表1pcr反应体系

表2实时荧光定量pcr反应体系

表3pcr和实时荧光定量pcr引物序列、退火温度及片段大小

表4实施例1与对比例1中堆肥方法的抗性基因去除率

表5实施例2与对比例2中堆肥方法的抗性基因去除率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

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